PHA复方制剂对鸡免疫功能及相关细胞因子的调节作用

刘艳艳，秦 光，李继昌

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

植物凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一类具有专一性、可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白，在兽医临床上可用做广谱抗病毒药、高效免疫增强剂；植物血凝素无种属特异性，可广泛用于家禽[1]、猪[2]等动物以增强免疫力。在饲料中添加黄芪多糖（Astragalus Plysaccharides，APS）可以改善蛋鸡的免疫功能[3]，在饲料中添加APS可促进肉仔鸡内脏器官的发育[4]。经体外试验[5]验证，自制PHA、黄芪多糖为主的复方制剂对鼠脾脏淋巴细胞有调节作用。药物对机体的免疫调节作用会影响体内相关的免疫调节因子，IFN-γ（Ⅱ型干扰素）是体内重要的免疫调节因子，主要由T细胞、树突状细胞及NK细胞分泌，对天然免疫与获得性免疫均具有重要的作用。IFN-γ是在机体抗感染防御与Th1应答中发挥着重要作用的细胞因子，其主要的功能是免疫刺激和免疫调控，如促进巨噬细胞的抗原呈递、激活巨噬细胞溶酶体的活性、促进NK细胞的活化、激活抗原递呈细胞、促进Th1细胞的分化及抑制Th2细胞的活化等[6-7]，同时也参与了某些自身免疫性疾病的发生，如多发性硬化症、类风湿性关节炎及Ⅰ型糖尿病[8]。IL-10由Th2细胞分泌，本身可以被Th1分泌的细胞因子抑制，并具有抑制Th1细胞产生细胞因子，促进胸腺细胞增殖，促进B细胞增殖等功能。过量的Thl细胞产物可引起局部慢性炎症和基质破坏。控制Th1型细胞因子的产生或补充Th2型细胞因子如IL-4、IL-10，调节它们的平衡有治疗意义[9]。

本研究首先进行PHA、黄芪多糖及其复方对鸡脾脏淋巴细胞的增殖试验，进一步证明该复方制剂的体外药效，并检测复方制剂对新城疫Lasota疫苗免疫鸡的体重、胸腺、脾脏、法氏囊的脏器指数影响，对刀豆球蛋白（ConA）诱导鸡脾脏淋巴细胞中及新城疫Lasota疫苗免疫鸡的外周血清中IL-10、IFN-γ浓度的影响，探讨该复方制剂对鸡及Thl、Th2型细胞因子的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

PHA复方制剂：由东北农业大学药理教研室自制，本品为灰白色粉末，不溶于水，临用时按剂量混悬于蒸馏水中；白细胞介素10试剂盒、干扰素γ试剂（购自上海劲马生物科技有限公司）；黄芪药材（购自哈尔滨世一堂）；ConA（购自Sigma）,批号20100108158；

鸡新城疫低毒力活疫苗Lasota株（1 000羽·支-1），乾元浩生物股份有限公司（批号S0912410）；

1.2 鸡脾淋巴细胞的制备

颈椎脱臼处死鸡（20～30日龄），无菌取脾脏，在不锈钢丝网上轻辗，收集网下的细胞悬液，用Hanks液洗涤细胞3次，当细胞存活率大于95%时，用完全RPMI-1640培养基调整细胞至所需浓度。

1.3 鸡脾淋巴细胞增殖试验中ConA浓度的确定

按1.2制备鸡脾淋巴细胞悬液。用完全RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×106细胞·mL-1，取96孔平底细胞培养板，每孔加入190 μL脾淋巴细胞悬液。加入不同浓度的ConA（0、0.625、1.25、2.5、5.0 和 10.0 μg·mL-110 μL。每孔总体积为 200 μL，每种处理均作4个复孔。将培养板置于37℃、5%CO2完全湿度的培养箱中培养48 h。培养结束后按MTT法检测细胞增殖[10]。

1.4 不同浓度药物的制备

根据药物PHA及黄芪多糖的临床常用的浓度，PHA 分别以 6.0、3.0、1.5 μg·mL-1，黄芪多糖以12.0、6.0、3.0 mg·mL-1将复方制剂药物按 120.0、60.0、30.0 mg·mL-1浓度稀释，备用。所有药物现用现制。

1.5 ConA诱导的鸡脾淋巴细胞因子检测

按1.2制备鸡脾淋巴细胞悬液。用完全RPMI-1640培养基调整细胞浓度5×106细胞·mL-1，取96孔平底细胞培养板，每孔加入190 μL脾淋巴细胞悬液。加入ConA（终浓度为1.25 μg·mL-1）和不同浓度的药物10 μL。每孔总体积为210 μL，每种处理均作四个复孔。将培养板置于37℃、5%CO2完全湿度的培养箱中培养48 h。培养结束后，各试验组四个复孔培养液移入离心管内，离心5 min（1 500 r·min-1），收上清，备用。IFN-γ、IL-10细胞因子的检测按照说明操作。

1.6 动物分组与处理

1日龄伊莎公鸡150只，购于东北农业大学种鸡场，在洁净动物房内饲养。至24日龄时，检测母源抗体为3以下，随机分为5组，分别是空白组：灌服蒸馏水，不进行免疫；疫苗对照组：灌服蒸馏水，在25、35日龄时滴鼻点眼免疫2次，免疫剂量按说明操作；3个不同剂量复方制剂组的免疫时间同疫苗对照组，给药剂量结合文献[11-12]及预试结果，按0.05、0.2、0.3 g·kg-1剂量连续灌服3 d。各组灌服体积为2 mL。

1.7 试验材料选取与处理

在雏鸡34、44、51日龄时，即初次免疫给药一周、再次免疫给药一周及再次免疫给药两周时各组随机取5羽，称重，心脏取血，分离血清进行IFN-γ、IL-10细胞因子的检测；方法按照说明操作。精密称定胸腺、脾脏、法氏囊的重量，进行体重增重率和免疫脏器指数的测定

1.8 数据处理

采用SAS软件进行数据处理，所有数值均表示为“平均值±标准差”的形式。

2 结果与分析

2.1 ConA浓度的确定

由表 1 可知，当 ConA 浓度为 5 μg·mL－1时，刺激鸡脾淋巴细胞增殖的效果最显著。本试验采用的 ConA 浓度为 1.25 μg·mL－1，在此浓度下 ConA 可显著促进鸡脾淋巴细胞增殖（P＜0.05）。

2.2 植物血凝素与黄芪多糖对ConA诱导的鸡脾脏淋巴细胞培养液中细胞因子浓度测定

由表2可知，复方制剂及其主要组成药物多糖、PHA均可以促进鸡脾脏淋巴细胞产生IL－10、IFN－γ的细胞因子，并以复方制剂组所产生的因子浓度最高（P＜0.01），说明此复方制剂组方合理。对于IL－10，在复方组成的高浓度、中浓度组中最高，多糖的表达浓度随剂量变化呈负相关，PHA的表达与浓度无相关；对于IFN－γ，同样在复方组成的高浓度、中浓度组中最高，PHA的增殖变化与浓度呈正相关，即浓度越高，增殖率也越高。在多糖中与剂量无关。

表1 不同浓度ConA对鸡脾淋巴细胞的增殖作用（n=5）Table 1 Chicken spleen cells proliferation activity of different concent of ConA（n=5）

表2 黄芪多糖、PHA及其复方制剂对鸡脾脏淋巴细胞培养液细胞因子的影响结果(n=5)Table 2 Effects of polysaccharide,PHA and compound peparation on cytokine contents in supernatant of chicken splenic lymphocyte(n=5)

2.3 PHA复方制剂对体重增重率及免疫脏器指数影响

结果见表3。

由表3可知法氏囊、脾脏、胸腺的重量可用来评价雏鸡的免疫状况，PHA复方制剂对，体重的增重率、免疫脏器指数的变化。

表3 不同免疫时期鸡增重率及胸腺、脾脏、法氏囊脏器指数测定结果（n=5）Table 3 Results of percentage of liveweightgrowth and organ index of thymus,spleen,and bursa of Fabricius of chickens in differents immune period（n=5）

在34日龄时，疫苗对照组的体重增重率显著性高于空白对照组（P＜0.05），在44日龄时持平，54日龄时低于空白对照组（P＜0.05）说明新城疫Lasota疫苗可以在免疫初期提高体重的增重率；对于各给药组，复方制剂低、中、高剂量组在在不同日龄高于空白对照组与疫苗对照组，以复方制剂低、中剂量组增重率显著（P＜0.05），以上结果说明此复方制剂对体重有一定影响，在初次免疫时可使增重率显著增加。

在整个免疫阶段胸腺指数疫苗对照组与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），说明疫苗对胸腺指数无影响；对于各给药组，复方制剂中剂量组在不同的免疫增强阶段都显著性高于空白对照组和疫苗对照组（P＜0.05），低剂量组也在一定时期显著性高于空白对照组和疫苗对照组（P＜0.05），说明该复方制剂可以提高胸腺指数，以中剂量组提高效果最佳。

疫苗有在免疫初期可以显著增加脾脏指数（P＜0.05）；低剂量、中剂量组在中期、后期显著性（P＜0.05）高于其他各组，说明此复方制剂可以提高脾脏指数，以中剂量组提高效果最佳。

法氏囊指数疫苗对照组与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），说明疫苗对法氏囊指数无影响；给药组在不同时期都有显著性高于对照组（P＜0.05）时，但34日龄低剂量组与51日龄低、高剂量组等无显著性差异，说明复方制剂在此剂量范围内可以增加法氏囊指数，以复方制剂中剂量组较为明显。

2.4 PHA复方制剂对鸡血清中细胞因子影响的检测结果

PHA复方制剂对鸡血清中细胞因子影响的结果见表4。

表4 PHA复方制剂对鸡血清细胞因子浓度影响(n=5)Table 4 Effects of PHA compound peparation on cytokine contents in serum of chickens(n=5)(ng·L-1)

IL-10在鸡血清中的浓度，在34日龄时，疫苗对照组低于与空白对照组（P＜0.01），但在44、51日龄时，则高于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01），说明在二次免疫后，疫苗可使IL-10增高；各给药组，在34日龄时复方制剂低剂量、中剂量组显著性高于其他各组（P＜0.01），复方制剂高剂量组与疫苗对照组无显著性差异（P＞0.05）；44日龄，复方制剂中剂量组仍显著性高于其他各组（P＜0.05），复方制剂低剂量、高剂量与空白对照组相同，但低于疫苗对照组（P＜0.05）；51日龄各给药组均显著性低于疫苗对照组（P＜0.01），说明复方制剂在34、44日龄时有提高IL-10的作用。

IFN-γ在鸡血清中的浓度，空白对照组、疫苗对照组一直无显著性差异（P＞0.05），说明新城疫LaSota疫苗对IFN-γ无明显影响；对于复方制剂给药组，复方制剂中剂量组，低剂量组在34、44日龄时一直显著性低于疫苗对照组和空白对照组（P＜0.05），但随着免疫的加强的进行，在51日龄有所升高，但与两个对照组无显著性差异（P＞0.05），说明复方制剂在免疫初期可使IFN-γ降低，加强免疫两周后无显著影响。

3 讨论与结论

免疫脏器指数在一定程度上可以作为衡量免疫作用大小的指标。本试验中，在不同的免疫时期，PHA复方制剂各给药剂量组，以中剂量组可明显提高多各免疫脏器指数，在一定剂量下，有增加体重的作用。毛小娟等研究表明[13]，黄芪多糖能增加正常小鼠脾脏的重量，且能完全对抗皮质激素引起的胸腺及肠淋巴结的显著萎缩，并可对抗环磷酰胺造成的脾脏重量显著下降；PHA复方制剂各给药剂量组以中剂量组可以明显提高多个免疫脏器指数，这与孙才华[14]报道一致，即从中药方剂中提取的复合多糖能促进正常雏鸡腔上囊、脾、胸腺的发育，其相对重量明显增加；张乐萃等认为复方中药多糖能够促进雏鸡免疫器官的生长发育，从而提高机体免疫功能[15]。本研究表明该复方制剂可以通过增加脏器指数提高机体免疫力，与其主要成分黄芪多糖相一致，并说明此复方制剂的药效与剂量有关系，并非剂量越大，效果越好，说明该复方制剂的给药剂量非常关键。

在免疫系统中，T细胞占有极其重要的地位，Momsnnaeta等首先根据长期培养的小鼠CD4+T细胞分泌细胞因子和介导免疫功能的不同[16]，将其分为Thl和Th2两个亚群，Thl细胞以表达IFN-γ[17]和IL-2[18]为主，Th2细胞以表达IL-10、IL-4为主。Thl和Th2在介导机体免疫应答过程中有不同的作用,前者主要参与促进细胞免疫应答，后者主要参与促进体液免疫[19]。Thl/Th2失衡一直被认为是许多疾病的发病机制之一。

本试验研究表明不同浓度复方药物及其主要成分PHA和黄芪多糖对鸡脾脏淋巴细胞培养液中细胞因子的含量有不同程度的影响，复方药物比任意单味药调节细胞因子的能力都强，说明此复方在调节相关细胞因子时具有协调增强的作用，组方合理。自制复方制剂在按体重0.05、0.2、0.3 g·kg-1的给药范围内，可提高胸腺等免疫脏器的指数，说明具有一定的免疫增强作用，并在外周血中有短时促进Th2型的IL-10的产生，暂时降低TH1型细胞因子IFN-γ的产生，这些结果意味着复方免疫增强剂可以通过调节Thl/Th2的比例起到免疫调节作用。

综上所述，以PHA、黄芪多糖为主药的复方制剂可以提高新城疫疫苗的免疫作用，具有免疫增强的作用，其机理与调节Thl/Th2的作用有关。

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