荧光PCR快速检测艰难梭菌

吴劲松 浙江省湖州市南浔人民医院检验科 湖州 313000

艰难梭菌（clostridium difficile，CD）又称难辨梭状芽孢杆菌，是一种厌氧革兰染色阳性芽孢杆菌，广泛分布于自然环境及动物和人的粪便中，主要通过粪-口途径传播[1-2]。艰难梭菌是引起医源性腹泻的重要病原菌，与大量抗生素使用有关，其感染典型表现是伪膜性肠炎[3-4]。目前全球特别是欧洲和北美艰难梭菌感染的流行暴发迅速增多，严重病例数、复发率和病死率均明显上升，耐药菌株也在增多，给该病的临床诊断和治疗提出新的挑战[5]，因此临床实验室对其快速而准确的识别、鉴定具有重要意义。笔者采用实时荧光PCR方法对艰难梭菌进行快速检测鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌 株 艰难梭菌标准菌株（ATCC9689）及其它引起腹泻致病菌如福氏志贺菌ATCC51311，空肠弯曲菌ATCC33560，产单核李斯特菌ATCC7644，霍乱弧菌ATCC16026，肠出血性大肠埃希菌O157：H7 ATCC43889，沙门菌 ATCC50041／ATCC14028，副溶血性弧菌ATCC20506。均购于中国微生物菌种库。

1.2 粪便标本 278例粪便标本均来自我院2010年1月—2010年12月住院腹泻患者，所有标本采集后均保存于4℃，并在4h内完成检测。

1.3 艰难梭菌毒素检测 采用法国生物梅里埃公司的VIDAS难辨梭菌毒素检测试剂对上述粪便标本艰难梭菌感染情况进行分析。

1.4 基因组DNA提取 菌株基因组DNA提取采用Promega公司WizardGenomic DNA Purification Kit试剂盒，粪便基因组提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA stool Mini Kit试剂盒，按照操作说明进行。

1.5 荧光定量PCR 根据艰难梭菌TcdB基因序列采用Primer Express3.0软件（ABI）设计特异性引物和探针，上游引物：5’-GAAAGTCCAAGTTTACGCTCAAT-3’；下游引物：5’-GCTGCACCTAAACTTACACCA-3’；荧光探针：5’-FAM-ACAGATGCAGCC AAAGTTGTTGAATT-TAMRA-3’。按照以下体系配制反应液：5.0μL10×PCR buffer，7.0μL 25mM Mg2+，4.0μL 2.5mM dNTP，10μM 上下游引物各 2.0μL，10μM 荧光探针 0.5μL，5U/μL Taq 酶 1.0μL，模板DNA 5.0μL，双蒸水补足 50μL；在 ABI7000 荧光定量 PCR 仪上按照 94℃变性 5min，94℃15s、60℃60s的循环条件扩增40个循环后观察分析结果。

1.6 标准品构建 将PCR扩增产物纯化后连接到pGEM-T载体上，并转化至JM-109感受态细胞中，37℃培养过夜，挑取单个菌落，以上游引物和下游引物进行PCR筛选挑取阳性克隆。重组质粒采用质粒DNA提取试剂盒（OMEGA）提取。用紫外分光光度计定量后，用含10ng/mL鲑鱼精DNA的1×TE（pH8.0）连续 10 倍稀释至浓度在 1.0×100～1.0×109拷贝/μL之间，取5μL作为模板。

2 结果

2.1 荧光PCR鉴定艰难梭菌特异性评价 本研究根据艰难梭菌tcdB基因作为检测的靶基因，设计的引物和荧光探针序列通过BLAST比对分析未发现与其同源序列，说明引物探针的特异性较好。通过与本实验室保存的福氏志贺菌、空肠弯曲菌、产单核李斯特菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7、沙门菌和副溶血性弧菌同时进行荧光PCR检测，结果表明仅有艰难梭菌出现阳性响应，其他无阳性信号，说明该方法特异性较好。

2.2 荧光PCR检测艰难梭菌线性范围分析 采用本研究建立的荧光PCR方法检测上述系列稀释的1.0×100～1.0×109拷贝/μL 的标准品，结果显示，100～107拷贝/μL的8个梯度标准品均出现响应信号，而且CT值与拷贝数的对数具有较好的线性关系，说明本研究建立的方法能够检测1个拷贝的艰难梭菌，具有较高的灵敏度。

2.3 临床粪便标本检测 采用生物梅里埃公司的VIDAS方法对278份粪便标本进行检测，结果显示，艰难梭菌毒素阳性样本18份；采用荧光PCR方法检测显示艰难梭菌阳性标本20份。两种方法检测艰难梭菌阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

艰难梭菌是引起医源性腹泻和抗生素相关性腹泻的重要病原菌，一旦医院感染暴发，芽胞的高抵抗力将使感染难以在短期内得到有效控制。因此，临床快速诊断艰难梭菌极其重要。艰难梭菌主要分泌细胞毒素而致病，不含毒素基因的无毒菌株为非致病菌[6]。因此单纯在粪便培养中分离出艰难梭菌的诊断意义不大，必须进行毒素的检测。所以，国际公认的检测“金标准”仍然是传统的粪便标本培养和细胞毒素测定[7]。但细菌培养法不仅操作繁琐耗时而且容易漏检，不适合快速诊断。目前一些实验室采用酶免疫方法检测艰难梭菌，虽然该方法操作简便快速，但其灵敏度不高并且存在交叉反应等问题[8]。PCR应用于临床微生物领域最大的优点在于其能够快速检测病原体而达到快速诊断的目的[9]。本研究建立的定量检测艰难梭菌的荧光PCR方法能够从粪便中直接检测分泌毒素的艰难梭菌，并且具有较好的特异性，而且能够检测1个拷贝的艰难梭菌，具有较高的灵敏度；本方法与生物梅里埃公司的VIDAS方法比较具有较高的一致性，因此本方法能够应用于临床检测艰难梭菌感染，对快速诊断艰难梭菌感染，控制医源性感染具有重要意义。

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［5］李永强，聂玉强，杨银梅.临床分离艰难梭菌的耐药性分析［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2010，19（10）：922-925.

［6］ Heinlen L，Ballard JD.Clostridium difficile infection［J］.Am J Med Sci，2010，340（3）：247-252.

［7］Stoddart B，Wilcox MH.Clostridium difficile［J］.Curr Opin Infect Dis，2002，15（5）：513-518.

［8］Pawlowski SW，Warren CA，Guerrant R.Diagnosis and treatment of acute or persistent diarrhea［J］.Gastroenterology，2009，136（6）：1874-1886.

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