王氏保赤丸中大黄5种成分的HPLC测定

陈广通，汪冬庚，李玉琴

（南通大学医学院，江苏 南通 226001）

王氏保赤丸系清代名医王胪卿祖传秘方，主要用治小儿乳滞疳积、感冒发热、喘咳痰鸣、胃呆食减、呕吐腹胀、痰厥急惊等症，该方由大黄、黄连、制南星、川贝母、巴豆霜等制成［1-3］。文献报道［4-10］王氏保赤丸的质量控制研究多为薄层扫描法，多以单一成分为指标控制王氏保赤丸的质量。本实验首次应用高效液相色谱建立了同时测定主药大黄中5种活性成分：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的方法，可作为控制王氏保赤丸质量的有效手段。

1 材料

岛津LC-20AD高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，LC-20AD泵；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚（中国药品生物制品检定所，纯度均为98％）；王氏保赤丸（南通精华制药股份有限公司，批号090827，091022，091201）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为自制重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Shimadzu VP-ODS柱（4.6～250mm，5μm）；流动相乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱；检测波长254nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；在该色谱条件下，5种有效成分均被洗脱且达到基线分离，色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取王氏保赤丸研细，精密称取细粉1.0μg，加甲醇50mL，超声提取15min（2次），滤过，合并滤液，浓缩至干，加10％盐酸20mL，混旋后用氯仿60mL分3次萃取，合并萃取液，回收氯仿，残渣用甲醇溶解并定容至25mL，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称取对照品芦荟大黄素10.5μg，大黄素10.5μg，大黄酸4.19μg，大黄酚4.63μg，大黄素甲醚4.36μg分别置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得各对照品贮备液。再分别精密吸取各对照品贮备液1、2、10、5、10mL置同一蒸发皿中，蒸干后，残渣用甲醇溶解，并定容于5mL量瓶中，混匀，得对照品混合溶液。

2.2.3 阴性对照液 按本品制剂工艺制备不含大黄的制剂，同供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照液。

2.3 线性关系的考察 精密吸取上述对照品混合溶液1、4、8、12、20μL依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归处理。芦荟大黄素的回归方程为Y=2 630 241.389 6X-38 601.111 3，r=0.999 6，线性范围为0.042～0.840μg；大黄酸的回归方程为Y=1 234 944.446 7X-98 333.469 5，r=0.9998，线性范围为0.168～3.352μg；大黄素的回归方程为Y=1 527 103.668 8X-21 953.773 6，r=0.999 7，线性范围为0.084～1.680μg；大黄酚的回归方程为Y=2 105 701.919 3X-23 364.479 5，r=0.999 9，线性范围为0.093～1.852μg；大黄素甲醚的回归方程为Y=807 372.109 6X-6 211.136 8，r=0.999 4，线性范围为0.174～3.49μg。

图1 王氏保赤丸的高效液相色谱图

2.4 精密度试验 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，连续进样5次，测定5种活性成分的峰面积，计算各成分的RSD。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为：2.20％、2.83％、1.52％、2.46％和1.67％，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，分别在0、2、4、6、8h进行测定。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.71％、1.57％、2.24％、1.54％和1.37％，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 按照样品制备方法平行制备5分同一批供试品溶液，分别依次测定。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为2.00％、2.11％、2.11％、2.14％和1.85％，表明此法重现性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的王氏保赤丸供试品1.0μg共5分，再分别精密加入对照品混合溶液0.7mL，使各成分含量分别约为0.062、0.21、0.14、0.26、0.21μg。按照“2.2”项下的方法配制回收率试验溶液，进样测定各成分的含量，计算得各成分的回收率分别为：99.8％、99.0％、100.0％、98.6％、100.2％，RSD分别为1.30％、1.74％、0.89％、0.86％和1.07％（n=5）。

2.8 样品的测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，按上述色谱条件测定，以外标一点法计算样品中大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，3批样品（批号090827，091022，091201）测定结果见表1。

表1 样品含量测定结果 mg/g

3 小结

供试品溶液制备时考察了加热回流和超声处理，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液并进行测定，结果表明，加热回流5h与超声处理30min的测定结果一致。由于超声提取操作简便，时间短，故确定提取方法为超声提取。该方法操作简便，结果准确，可靠，重复性好，可以作为该产品质量控制的方法。

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