甜叶菊组织培养研究进展

周玉丽 ，崔广荣 ，张子学 ，胡能兵 ，何克勤 ，林 平 ，舒英杰

（1.安徽农业大学，合肥 230000；2.安徽科技学院，凤阳 233100）

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）又名“甜菊”、“甜草”，菊科甜叶菊属，原产南美洲巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉[1]。1976年南京中山植物园从日本引种甜叶菊试验成功后，20世纪80年代初全国各地开始种植，目前我国是世界上甜叶菊种植面积最大的国家，在江苏、福建、广东、浙江、山东、河南、安徽、新疆等地均有大面积种植，总植面积超过6万hm2[2]。

甜叶菊是理想的甜味剂，其叶片富含甜叶菊糖苷，因其具有甜度高（甜度是蔗糖的350～400倍）、热量低（热量约为蔗糖的1/300）、安全无毒等特点[3－4]，加之甜叶菊糖苷有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，亦有治疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效[5－6]，甜叶菊深受肥胖症患者和糖尿病人的青睐。另外，甜叶菊可增进家畜、赛马和宠物的食欲并能治疗它们的慢性疾病及牛的不孕症，已引起国外畜牧和饲料工作者的关注[7]。在日本和巴西，甜叶菊糖苷已成为蔗糖的替代品被广泛应用，在南美、东南亚、远东地区，甜叶菊糖苷已被广泛应用于食品和药品领域[8]，在国际上被誉为“世界第三健康糖源”[9]。我国卫生部于1985年和1990年分别批准了甜叶菊糖苷为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料[10]。因此，甜叶菊逐渐成为食品和医药领域研究开发的热点。

由于种子极小（千粒重约0.02g），甜叶菊不利于实生繁殖；甜叶菊为异花授粉植物，不利于杂交种的纯合及品种的防杂保纯，因此，甜叶菊的组培快繁成为了甜叶菊工厂化育苗的主要措施。20世纪七、八十年代，中国科学院植物研究所、复旦大学和中国科学院武汉植物研究所在我国较早地开展了甜叶菊组织培养研究。目前，人们对甜叶菊的无菌繁殖体系、培养基和培养条件的选择、愈伤组织的诱导与分化、芽分化和继代增殖培养、生根培养以及组培苗的移栽等方面作了较为全面、系统的研究。

1 甜叶菊无菌繁殖体系建立的研究

1.1 外植体的选择与消毒

外植体的选择是植物离体培养成功的关键环节之一，到目前为止人们已成功利用甜叶菊种子[11]、茎尖[12]、叶片[13-14]、叶柄[15-16]和茎段[17]等获得了再生植株，其中茎尖是甜叶菊组织培养最理想的外植体材料[18-19]。甜叶菊最适外植体的选择，应依不同的实验目的而定，若为了获取愈伤组织，叶片、茎节和茎段是较为理想的外植体材料[21-23]；但若要繁殖大量试管苗，茎尖则是最为理想的材料[18]。

植物组织培养中，外植体灭菌、消毒剂种类及消毒时间对外植体存活率都有明显影响，消毒时间过长可能引起外植体褐变而降低存活率，过短则达不到消毒目的。甜叶菊外植体常用的消毒剂为75%酒精和0.1%HgCl2，一般将70%～75%酒精和0.1%HgCl2配合使用。徐慧珠等[13]取当年生或宿根植株上已展开的幼叶，洗净后用0.1%HgCl2消毒3～5min，用无菌水冲洗4～5次，然后用整叶或将叶剪成0.25cm2大小接种于固体培养基上成功诱导分化出完整甜叶菊植株。黄苏珍等[16]将甜叶菊顶芽和叶柄，先用自来水冲洗净，再用10%的洗衣粉溶液浸泡5min后，经70%的酒精表面消毒2min，用0.1%的HgCl2溶液消毒5min，然后用无菌水冲洗3～5次，消毒效果较好。沈秀丽等[15]将甜叶菊种子在70%酒精浸20s，再放入0.1%HgCl210min，然后用无菌水冲洗干净，培养获得了无菌植株。崔广荣等[23]研究表明，70%酒精处理15～30s+0.1%HgCl2处理4min较为适合甜叶菊茎段外植体灭菌。

1.2 基本培养基与培养条件的选择

甜叶菊组织培养目前主要采用MS，1/2MS，1/4MS为基本培养基，愈伤组织及继代增殖主要用MS培养基，生根培养主要用1/2MS和1/4MS培养基。但也有用B5[24]、White[14]、H[13]和N6[25]为基本培养基获得试管苗的报道。沈秀丽等[25]研究表明，选用MS为基本培养基，比以N6、B5为基本培养基的愈伤组织形成及出芽率都高。在碳源的选择上，以3%蔗糖效果最好，以葡萄糖、麦芽糖作碳源，无论是愈伤组织形成，还是出芽率都较低。Dhir等[26]研究了蔗糖、葡萄糖和麦芽糖对茎尖及腋芽诱导率的影响，结果表明蔗糖和葡萄糖相对较适不定芽的诱导。Bondarev等[27]的研究表明，在附加果糖或葡萄糖的MS培养基中甜叶菊芽的生长发育情况要优于添加蔗糖的培养基。

植物组织培养中外界环境条件是一个较为重要的因素，主要包括光照、温度、湿度、培养基酸碱度和气体成分等方面。研究表明，甜叶菊组织培养较为理想的培养条件为培养基pH值5.5～6.0、光照强度1500～3000lx、光照时间 12h～14h/d、RH 60%～70%、培养温度 23～28℃[11，18，21～22，28]。

2 甜叶菊愈伤组织的诱导与分化研究

植物各种器官的外植体在离体条件下，细胞经过脱分化等一系列过程，转变为分化细胞，继而转变成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，成为愈伤组织，植物生长调节剂是诱导愈伤组织成败的重要因素。许多研究表明，BA、6-BA和NAA是诱导愈伤组织的主要植物生长调节剂，但不同研究者、不同品种和不同材料的结论不同。王凯基等[29]研究表明，生长素种类对诱发甜叶菊愈伤组织影响不大，而对愈伤组织的形态起着不同的调节作用。臧淑英等[30]研究表明，单独添加NAA 0.5mg/L或2，4-D 0.2mg/L的MS培养基对甜叶菊离体茎段愈伤组织的诱导率分别为88%和76%，基本培养基中不补加任何激素或单加一种细胞分裂素，都不能诱导茎段产生愈伤组织。倪德祥等[31]研究表明，甜叶菊叶片和茎段分别接种在附加不同浓度NAA和BA的培养基后，叶与茎愈伤组织和器官发生的潜力不同，叶片培养可诱导发生芽和根，而茎段培养只能诱发根，高浓度的 NAA 有利于促进愈伤组织生长；MS+BA（2～10mg/L）+NAA（0～2mg/L）的培养基有利芽发生，MS+BA（0～0.2mg/L）+NAA（2～10mg/L）有利诱导发根。Ferreira等[32]研究发现，在添加 BA 0.5mg/L 和 2，4-D 1.0mg/L 的 LS液体培养基中进行甜叶菊细胞悬浮培养，每隔6～7d继代培养1次，20～30d后可获得愈伤组织。陈少瑜等[33]以叶片为外植体，在MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.2mg/L+BA 0.5mg/L的培养基上诱导出黄色疏松型愈伤组织，而在MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基上诱导出了绿色坚硬的愈伤组织。沈秀丽等[25]研究表明，用MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基，愈伤组织的诱导率达83%。叶军等[34]取甜叶菊无菌苗的幼苗叶片，分别接种于MS+6-BAP 1～3 mg/L+NAA 2 mg/L的培养基中获得了愈伤组织。娄玉霞等[14]以甜叶菊叶片为外植体，在附加300mg/L水解酪蛋白MS基本培养基上，离体叶片在BA和NAA均为0.5mg/L的培养基上诱导形成愈伤组织，BA 0.5mg/L和NAA 0.05mg/L的培养基上可诱导愈伤组织100%分化不定芽。Tadhani等[35]在MS培养基上添加NAA 2.0 mg/L和6-BA 0.3mg/L的也可诱导出了大量愈伤组织。Banerjee等[36]利用添加不同蓝藻混合物的培养基诱导叶片愈伤组织的形成，蓝藻的最佳添加量为5mL/L和10mL/L。

3 甜叶菊芽分化和继代增殖培养研究

根据外植体分化和生长的方式不同，继代培养中培养物的增殖方式也各不相同，就目前而言，甜叶菊的继代增殖方式主要有3种：多节茎段增殖、丛生芽增殖和不定芽增殖。徐惠珠等[13]把愈伤组织转移到细胞分裂素和生长素比例为0.65∶1～10∶1的分化培养基上后，发现愈伤组织结构日趋致密，颜色逐渐变绿，40～60d后即可分化出芽。Tamura等[37]以带叶原基的茎尖为外植体，在添加KT 10mg/L的基本培养基中直接诱导出了大量丛生芽。Lee等[38]认为，在以MS为基本培养基，附加NAA 0.1 mg/L时，添加KT比添加BA更有利于甜叶菊茎尖的增殖。黄苏珍等[16]在“中山一号”甜叶菊快繁中发现，在MS附加ZT 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L的培养基上，每3～4周可增殖5～6倍。Mitra等[39]在添加KT 10 mg/L，IAA 1.0 mg/L和AdS 30 mg/L的培养基中诱导不定芽的分化，4周内出芽率达90%。张子学等[40]研究表明，适宜甜叶菊增殖的培养基为MS+BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L，最高增殖倍数达14.4倍。董振红等[28]采用甜叶菊的幼嫩茎尖为外植体，在MS基本培养基添加6-BA 1.0mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L的诱导培养基上。进行丛生芽的诱导培养，不感染病菌的情况下，诱导出芽率可达100%；继代增殖培养基采用MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L，继代培养30d后，丛生芽数可增殖14～15倍。Jain等[41]在添加BAP 2.2μM和IAA 2.8μM的MS培养基上以叶片和茎段为外植体，直接诱导产生了不定芽。袁学军等[11]研究表明，以甜叶菊种子为外植体，认为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L最适于丛生芽诱导，诱导率为98.6%。崔广荣等[23]研究表明，MS培养基中添加6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L适合试管苗增殖，增殖系数可达7.4。

4 甜叶菊组培苗生根培养研究

组培苗生根有两种方式，一种是试管内生根，一种是试管外生根。目前有关甜叶菊试管内生根的报道较多，甜叶菊组培苗生根培养以MS、1/2MS和1/4MS为主，同时添加不同浓度的NAA、IBA或二者组合。甜叶菊在试管中生根效果较好，黄苏珍等[16]研究表明，甜叶菊“中山一号”品系以MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L生根效果最好，ZT抑制根的发生。娄玉霞等[14]以离体叶片诱导形成愈伤组织并诱导分化不定芽，不定芽在附加NAA 0.01mg/L的White基本培养上诱导生根，生根率可达100%。Sivaram等[42]认为，添加IBA 4.9μM的1/2 MS培养基诱导不定芽生根效果要好于添加同样浓度IBA的MS培养基，生根培养30d后能够诱导出12～13条长且浓密的根，生根率达100%。Bondarev等[27]则认为，NAA对甜叶菊根的形成无影响，而BA则强烈地抑制根系统的形成，但当添加赤霉素时，会有利于芽的伸长及根的诱导。Dhir等[26]将长至3～5cm的不定芽转入附加IAA或IBA（1～4mg/L）的生根培养基中，移栽后成活率在95%以上。张子学等[40]研究表明，适宜甜叶菊生根培养基为MS+IBA 0.25mg/L，生根率达85.7%。董振红等[28]在MS＋IBA 0.1mg/L＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L＋活性炭1g/L的生根培养基上诱导生根，生根率达100%。崔广荣等[23]发现，在培养基添加0.0～0.5 mg/L的IBA或NAA均适合甜叶菊试管苗生根。甜叶菊试管外生根也是一种降低生产成本的有效措施，不仅可以减少无菌操作的工时消耗，而且减少了培养基制备材料与能源消耗。崔广荣等[43]采用甜叶菊组培苗扦插的方法实现了组培苗的试管外生根，栽插成活率达99%。

5 甜叶菊组培苗移栽研究

离体繁殖的组培苗能否大量应用于生产，是否有效益，关键是看组培苗能否有较高的移栽成活率。目前对甜叶菊组培苗移栽的报道不多，主要是关于移栽前的处理、移栽温度和湿度方面的研究。翁晓燕等[44]研究证明，2.5～10mg/L浓度的多效唑能有效提高甜叶菊试管苗移栽后的成活率，处理根系比叶面喷施效果更好，其中以5mg/L浓度在开盖炼苗浸根3d处理最为有效，移栽成活率达到92.4%，是对照的2.26倍。黄苏珍等[16]研究发现，甜叶菊组培苗出瓶后还须注意保湿和遮荫，使其逐渐适应外界环境，提高出瓶的成活率。董振红等[28]研究指出试管苗长至5～7cm时，组培苗出瓶前先敞口炼苗2d，生根苗移栽后成活率可达95%以上。

6 甜叶菊组织培养研究展望

国内外有关甜叶菊组织培养方面的研究已开展了30多年，无论在理论上还是技术上都取得了长足发展。目前人们已经初步建立了甜叶菊的快繁体系，但不同植物种类、同一物种的不同品种间（基因型不同）、同一植物的不同组织器官以及不同的培养阶段所需的植物生长调节剂均可能有所不同。如目前尚未见关于糖苷含量高及抗逆性强的甜叶菊品种的组培快繁体系建立的报道，因此，摸索不同甜叶菊品种（系）或不同组织器官以及不同培养阶段的快繁体系仍然还有很多工作要做。今后，应在不断完善不同甜叶菊品种的快繁技术体系的基础上，将甜叶菊组织培养与种质资源、优良品种选育以及基因工程等生物技术联系起来，如将甜叶菊组织培养应用于种质资源的离体保、转基因、原生质体培养和体细胞杂交等。另外，为了实现产业化开发，应加强甜叶菊的工厂化育苗关键技术以及相关的组培苗移栽方面的研究。

[1]Yao Y，Ban M，Brandle J.A genetic linkage map for Stevia rebaudiana[J].Genome，1999，42（4）：657-611.

[2]丁宁，郝再彬，陈秀华，等.甜叶菊及其糖苷的研究与发展[J].上海农业科技，2005（4）：8-10.

[3]Curry L L，Roberts A.Subchronic toxicity of rebaudioside[J].Food and Chemical Toxicology，2008，46：11-20.

[4]Teo C C，Tan S N，Yong J W，et al.Validation of green-solvent extraction combined with chromatographic chemical fingerprint to evaluate quality of Stevia rebaudiana Bertoni[J].J.Sep.Sci，2009，32（4）：613-622.

[5]Chan P，Tomlinson B，Chen Y J，et al.A double-blind placbocontrolled study of the effectiveness and tolerability of oral stevioside in human hypertension[J].British Journal of Clinical Pharmacology，2000，50（3）：215-220.

[6]林美珍.甜叶菊的生药鉴定[J].井冈山学院学报，2006，8（27）：51-52.

[7]涟漪.用甜叶菊茎提取物治疗家畜乳腺炎[J].国外医药：植物药分册，2006，21（4）：182.

[8]Sehar I，Kaul A，Bani S，et al.Immune up regulatory response of anon-caloric natural sweetener，stevioside[J].Chemico-Biological Interactions，2008，173：115-121.

[9]倪军明，李军平.甜菊糖工业发展现状与前景［J］.广州食品工业科技，2004（3）：156-158.

[10]滕祥金，杨丹，孟滕，等.薄板层析法分析甜叶菊糖苷[J].中国糖料，2007（4）：24-25，31.

[11]袁学军，陈光宙，李艳丽，等.甜叶菊种子丛生芽诱导和植株再生[J].草原与草坪，2010，33（6）：55-56.

[12]樊映汉，臧淑英，张治明.甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）的茎尖培养[J].植物生理学通讯，1981（3）：28-31.

[13]徐惠珠，龚汉英.甜叶菊组织培养实验初报[J].湖北农业科学，1981（5）：35-36.

[14]娄玉霞，宋磊，李心国，等.甜叶菊叶片离体培养及试管无性系的建立[J].上海师范大学学报（自然科学版），2000，29（4）：74-77.

[15]沈秀丽，徐仲.甜叶菊组织培养条件的研究Ⅰ.外植体、激素浓度、琼脂浓度对愈伤组织形成及芽诱导的影响[J].中国糖料，1996（3）：24-26.

[16]黄苏珍，韩玉林，谢明云，等.甜叶菊“中山一号”快速繁殖研究[J].特产研究，1999（4）：48-49.

[17]尚宏芹.甜叶菊组培苗生根培养的研究[J].北方园艺，2010（6）：170-172.

[18]李启任，刘娟，董立华，等.甜叶菊茎尖组织培养快繁技术[J].云南大学学报（自然科学版），1992，14（4）：425-426.

[19]赫福霞，于晶，李茫雪，等.多因子正交试验对甜叶菊丛生芽诱导条件的筛选[J].中国农学通报，2005，21（7）：79-81.

[20]Knowles K，Dhir S，Dhir K S.Somatic embryogenesis and plant regeneration in Stevia rebaudiana[J].In Vtro Cellular&Developmental Biology，2004，40：40.

[21]Uddin S M，Chowdhury S H M，Khan M H，et al.In vitro propagation of Stevia rebaudiana Bert in Bangladesh[J].African Journal of Biotechnology，2006，5（13）：1238-1240.

[22]欧阳学智，洪维廉，陈睦传.甜菊叶愈伤组织诱导过程中叶绿体的超微结构变化[J].武汉植物学研究，1993，11（1）：61-64.

[23]崔广荣，何克勤，胡能兵，等.甜叶菊的组织培养[J].安徽科技学院学报，2011，25（5）：23-28.

[24]Miyagawa H，Fujioka N，Kohda H，et al.Studies on the tissue culture of Stevia rebaudiana and its components.（II）1.Induction of shoot primordia[J].Planta Med，1986，52（4）：321-323.

[25]沈秀丽，徐仲.甜叶菊组织培养条件的研究II.不同基本培养基、不同碳源对愈伤组织形成及芽诱导的影响[J].中国糖料，1997（4）：9-10.

[26]Dhir Shireen，Knowles K，Dhir K S.Regeneration and cloning of Stevia Plant：A low caloric Sweetener[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology，2004，40：39.

[27]Bondarev N，Reshetnyak O，Nosov A.Effects of nutrient mediumcomposition on development of Stevia rebaudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of steviol glycosides[J].Plant Science，2003，165（4）：845-850.

[28]董振红，王贵民，王彦超，等.甜叶菊茎尖组培苗生根及移栽的研究[J].中国糖料，2008（2）：28-29，39.

[29]王凯基，戴学方，刘家一，等.甜叶菊离体茎诱导完整植株初报[J].上海农业科技，1980（3）：30-31，33.

[30]臧淑英，张治明，樊映汉.甜叶菊离体茎段愈伤组织的诱导及植株再生[J].植物学报，1980，2（3）：295-296.

[31]倪德祥，张丕方，董崇楣，等.甜叶菊组织培养中愈伤组织和器官发生的发育形态学和植物激素调节的研究[J].上海农业学报，1985（1）：52-59.

[32]Ferreira M.C，Handro W.Production，maintenance and plant regeneration from cell suspension cultures of Stevia rebaudiana（Bert.） Bertoni[J].Plant Cell Reports，1988，7（2）：123-126.

[33]陈少瑜，李启任.生长调节物质对甜叶菊愈伤组织中甜菊苷含量的影响（简报）[J].植物生理学通讯，1993，29（4）：2665-267.

[34]叶军，陈睦传，沈明山，等.组培甜菊糖苷的变化研究[J].厦门大学学报（自然科学版），2000，39（2）：236-240.

[35]Tadhani B.M，Patel H.V，Subhash Rema.In vitro antioxidant activities of Stevia rebaudiana leaves and callus[J].Journal of Food Composition and Analysis，2007，20：323-329.

[36]Banerjee Meenakshi，Sarkar Priyanka.In vitro callusing in Stevia rebaudiana Bertoni using cyanobacterial media-a novel approach to tissue culture[J].International Journal of Integrative Biology，2008，3（3）：163-168.

[37]TamuraY，Nakamura S，Fukui H，et al.Clonal Propagation of Stevia rebaudiana Bertoni by stem-tip culture[J].Plant Cell Reports，1984，3（5）：183-185.

[38]Lee W C，Pak H C，Hughes G H.Tissues culture studies on Stevia rebaudiana as a source of new sweetener crop[J].Hort.Science，1990，25：1182-1183.

[39]Mitra A，Pal A.In vitro regeneration of Stevia rebaudiana （Bert） from the nodal explant[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2007，l6（1）：59-62.

[40]张子学，杨久峰，檀赞芳.植物生长调节剂对甜叶菊增殖和生根的影响［J］.中国林副特产，2008，93（2）：13-15.

[41]Jain Pourvi，Kachhwaha Sumita，Kothari L S.Improved micropropagation protocol and enhancement in biomass and chlorophyll content in Stevia rebaudiana （Bert.） Bertoni by using high copper levels in the culture medium[J].Scientia Horticulture，2009，119（3）：315-319.

[42]Sivaram L，Mukundan U.In vitro culture studies on Stevia rebaudiana[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology，2003，39（5）：520-523.

[43]崔广荣，林平，张从宇，等.甜叶菊无根组培苗扦插方法[P].中国专利：201010509352，2011-01-19.

[44]翁晓燕，余炳辉.多效唑对甜菊试管苗移栽后的生长和生理特性的影响[J].浙江农业大学学报，1994，20（1）：63-66.