组织培养技术在甜菜上的应用及未来展望

吴则东 ，王华忠

（1.黑龙江省普通高校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080；3.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨 150080）

植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎以及原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，进而培育成完整的植株[1]。Margara在1977年利用花芽和茎尖分生组织对甜菜首次成功进行组织培养，1978年，Hussey和 Hepher[2]利用甜菜腋芽进行组织培养，成功产生小苗，自此以后，甜菜组织培养在很多个国家相继展开，甜菜组织培养经过了30多年的发展，取得了一些成绩，例如利用未授粉胚珠培养单倍体、通过体细胞无性系变异产生新种质以及通过细胞融合技术创造新材料等等，但是和其它作物相比，甜菜组织培养也存在很多不足。本文对组织培养技术在甜菜上的应用进行综述，对未来发展方向进行展望。

1 组织培养技术在甜菜上的应用

1.1 对某些甜菜品系进行快速大量繁殖

对甜菜进行快速繁殖是组织培养最基本的功能。甜菜快繁的对象一般包括以下几个方面，一是刚刚发现的不育系，在未经保持系保持的情况下，利用组织培养进行快繁，以免材料丢失；二是新发现的、具有育种价值的稀少的野生材料，利用组织培养形成一定规模；三是对某些人工创制的稀有育种材料进行大量扩繁，形成品系；四是通过组织培养对转基因甜菜材料进行选择和扩繁。例如1992年，Goska等利用二倍体甜菜和三倍体甜菜杂交产生的9份甜菜三体材料，通过组织培养的方式进行扩繁[3]。

1.2 创造甜菜新种质

1.2.1 利用未授粉胚珠技术产生单倍体材料 甜菜属于异花授粉作物，甜菜由于自交不亲和，所以甜菜自交结实率非常低，很难产生纯系，但是如果利用未授粉胚珠培养技术培养单倍体，再利用秋水仙碱加倍形成二倍体，则即为二倍体纯系。将此技术和常规育种技术相结合，即可大大加速育种的速度。一般说来，稳定一个杂种后代需要12～13年的时间，有的需要更长，即便如此，有时候，后代还会出现变异，如中甜204的亲本之一D8361，由原始材料到稳定用了12年的时间；而甜研6号的亲本稳定用了将近16年的时间[4]。国外甜菜品种一般来说整齐度非常好，不论叶片还是根形差异不大；而国内有些甜菜品种相比较而言则整齐度较差，叶片的形状以及根形在一片地里很难保持完全的一致，而如果利用未授粉胚珠培养的技术，再通过染色体加倍，产生纯合的授粉系材料。如果我们的不育系材料一致性非常地好，那么我们育成的品种就会有非常好的一致性，这将极其有利于品种的鉴别以及预防假冒种子。甜菜品种中甜花培1号就是利用未授粉胚珠培养选出的高糖、抗病品种，其中纯合株系作为父本，四倍体材料为母本杂交而成，在4年内就创制出用于育种的新材料，提高了育种效率、缩短了育种周期[5]。

1.2.2 利用体细胞无性系变异产生抗性材料 植物组织培养所形成的愈伤组织或再生植株是由亲本植物细胞经有丝分裂和分化而产生的，其遗传组成似乎应当与原始亲本一致。但事实上无论有无诱变剂的存在，在再生植株中都存在着大量的遗传变异，这种变异称为“体细胞无性系变异”[6]。1990年，Freytag等人利用甜菜叶柄进行组织培养，采用了5个不同浓度的盐梯度，选择耐盐品系，然后将再生植株种植在包含盐浓度为0.1%的土壤中，从形态学上观察，发现和种植在无盐的土壤中没有什么差异，说明产生了耐盐的突变细胞[7]。马龙彪等人利用甜菜褐斑病菌毒素作为选择压力，设置不同的浓度梯度，对甜菜未授粉胚珠的抗性愈伤组织以选择压力，然后诱导产生植株，最后经过田间试验进行抗病性鉴定，证明经过选择压力存活的甜菜植株极大地增加了抗褐斑病的能力[8]。王红旗等利用甲基硫酸乙酯或紫外线对甜菜未授粉胚珠的愈伤组织进行诱变处理，然后利用褐斑病菌株施加选择压力，经扩繁、壮苗、生根后，进行移栽、镜检、加倍成苗后，在田间进行抗褐斑病试验，结果表明比对照种感病率轻1.5级以上[9]。Saunders将没有突变的悬浮细胞暴露在2.8nM的氯磺隆中，最终获得了一个含有显性单基因的抗磺酰脲类除草剂的品系[10]。

1.2.3 利用体细胞杂交技术创造新物种 体细胞杂交 （Somatic hybridization）即原生质体融合（Protoplast fusion），是生物技术中重要的领域之一，在植物种质资源创新和品种改良中发挥了独特的作用，并获得了一些新种质。它是指双亲的原生质体（可以是种间、属间、甚至科间）在特定的物理或化学因素作用下诱导融合成杂种细胞（核质杂种或胞质杂种），通过细胞分裂形成愈伤组织，并分化和再生出植株[11]。从中选优去劣，按育种目标要求培育出新品种，并创造出新物种。体细胞杂交产生的变异通常可以通过表型的变化观察到，有的则需要通过同工酶或者分子标记手段，例如RFLP及RAPD来加以分析[12]。但是甜菜的体细胞融合技术发展相对较慢，目前通过体细胞杂交创造甜菜新种质的报道较少，杨爱芳等[13]用PEG介导的方法诱导原生质体融合，从S10×7721及甜研302×7721的融合细胞获得了愈伤组织及胚状体。进一步通过染色体分析及同工酶谱分析确定了体细胞杂种植株，同时鉴定出一批如甜研302和S10的同源多倍体。

1.3 组织培养是开展基因工程必不可少的辅助手段

目前转基因技术发展得很快，例如甜菜也成功地转入了抗除草剂基因以及抗真菌病的几丁质酶基因等等[14]，而利用农杆菌介导法转入抗除草剂基因的甜菜品种已经应用在生产上超过了10年，为农民节省了大量的人力。但无论利用农杆菌介导法、基因枪法、电穿孔法还是微注射法，都要以组织培养技术作为依托。

1.4 保存甜菜种质

一般说来，甜菜是以种子的形式进行保存，育种家都会把自己掌握的资源在常温条件下进行保存，并且每隔几年进行1次繁殖，以防止种子发芽率降低。另外国家也有专门的中长期种子库，对种子进行低温保存。但是由于种质资源要经常进行繁殖，繁殖的过程不但要消耗很多的人力、物力，还可能会因为人为的错误造成混种，如不育系和保持系栽植距离过近，则极可能造成不育系中混入保持系，而造成不育系难以淘汰。另外对于某些难以用种子进行保存的资源或者某些稀缺资源，可以考虑用组织培养的方法进行种质保存。如新发现的不育系突变体、野生资源等等。同时，离体保存的材料不受各种病虫害侵染、不受季节限制，利于种质资源地区间及国际间的交换和转移，给保存和抢救有用基因带来了希望[1]。组织培养保存种质一般是在超低温条件（一般指液氮低温，-196℃）下，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进行，可以最大化、长期稳定地保存种质的基因型和表现型，并且占用最小的保存空间[15]。1982年，Miedema P对甜菜的不育系，二倍体及四倍体授粉系在5℃条件下进行组培保存，但是这种保存不但费时、费力，而且容易造成某些基因型的丢失[16]。甜菜的低温保存一般选取茎尖或者根尖，采用三碘苯甲酸或者二甲基亚砜作为冷冻保护剂[17-18]。甜菜玻璃化超低温保存技术一般要经过几个步骤，第一天进行预处理，再经过3d预培养和7h的脱水处理，但是这种复杂的程序已经进行了简化，现在只需要在含有0.3M的蔗糖培养基中5℃预处理1d，然后在20℃条件下用2M甘油和0.4 M蔗糖处理20min，在放入液氮之前，在0℃下脱水20min，解冻后组培成活率可以达到60%～100%[17]。

2 甜菜组织培养技术未来发展展望

甜菜组织培养技术从发展到现在虽然取得了一些成绩，如繁殖幼苗、未授粉胚珠培养等等，但是和其它作物相比，甜菜组织培养还有很多方面有待研究，还有很多工作需要努力，主要有以下几个方面。

2.1 进一步探索甜菜未授粉胚珠成活的限制条件

虽然甜菜未授粉胚珠培养已经取得了成功，并且成功地育成了品种，但是成活率受到甜菜基因型的影响很大，目前很多作物都已经建立了自己的DH（双单倍体）群体，用于开展遗传图谱和QTL定位的研究，但是由于甜菜未授粉胚珠成活率较低，平均只有10%左右，很难建成DH群体。因此今后有必要积极探索制约未授粉胚珠成活的因素。

2.2 利用体细胞杂交技术创造新种质

我国甜菜种质资源极其匮乏，而利用体细胞杂交则是创造种质资源的很好办法，但是由于我国在原生质体培养方面的技术还有待提高，因此体细胞杂交技术应用缓慢，这方面的报道也较少。因此甜菜原生质体成苗率将成为进一步研究的重点。

2.3 继续探讨研究低温保存甜菜种质的方法

国外对于低温保存甜菜种质研究的报告比较多，也取得了一定的进展，而国内在这方面还没有开展相关的研究，因此，国内也要积极开展低温玻璃化保存甜菜的机理以及更加优化的方法。

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