超声检查子宫内膜分型与孕酮受体表达的研究

王 宁 耿琳琳 张树成 贺 斌 王介东

国家人口计生委科学技术研究所(北京，100081)

胚胎着床是人类生殖过程中最关键的步骤之一，成功的着床依赖于胚泡的侵入能力和子宫内膜的容受性。人的子宫内膜在着床的过程中发挥关键作用。在每个月经周期，子宫只能在短暂的时间内接受胚胎完成着床，这一时期被称为“着床窗”，此时的子宫内膜处于接受状态。应用阴道超声检查来评估子宫内膜容受性阶段具有一定的意义［1］，根据排卵日B超检查子宫内膜的回声状态，将子宫内膜分为三线的A型和均匀的C型。一些研究报道A型组妊娠率高于C型［1，2］。目前这些尝试停留在临床阶段，关于子宫内膜超声分型的分子基础的相关研究很少。孕酮在女性生殖过程中起关键性作用［3，4］，与其受体结合激活了诸如排卵、子宫内膜容受性、着床、蜕膜化反应和妊娠维持等相关基因的转录。本研究通过检测孕酮受体A(PRA)和孕酮受体B(PRB)的mRNA和蛋白表达的情况，初步探讨超声检查评价子宫内膜容受性的分子基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2010年1～7月在国家人口计生委科研所临床中心就诊的20名不孕症妇女，年龄25～35岁。

1.2 仪器和试剂

主要仪器有GeneAmp RNA PCR system 9700、VIDAS全自动免疫酶标分析仪。主要试剂有雌二醇检测试剂盒(PI-30431，生物梅里埃公司)、孕酮

4 0

6

中国计划生育学杂志 2012年7月 第20卷 第7期 Chin JFam Plann，Vol.20，No.7，July 2012检测试剂盒(PI-30409，生物梅里埃公司)、鼠抗人单克隆体抗1A6(NCL-PGR，美国Leica公司)、兔抗人多克隆抗体PRB(MS-192-P1，英国Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 超声检查和研究分组 被检妇女自然月经周期第10天起每1～3天接受1次阴道B超监测双侧卵巢卵泡，同时观察子宫纵切面子宫内膜厚度及其回声情况，按文献［5］进行子宫内膜形态学分类:A型，典型三线型或多层子宫内膜，外层和中央为强回声线，外层与宫腔中线之间为低回声区或暗区;C型，均质强回声，无宫腔中线回声。根据超声检查不同类型内膜将研究对象分为A型组和C型组。

1.3.2 血清激素测定 经B超检测确认排卵后，在排卵后7d刮取两组子宫内膜2条，同时取空腹静脉血3ml。静脉血分离收集血清后，采用酶联荧光法(ELFA)按照雌二醇(E2)及孕酮(P)检测试剂盒操作说明书，利用VIDAS全自动免疫酶标分析仪检测血清中 E2和 P 的水平［6，7］。

1.3.3 RNA提取和RT-PCR 按照TRIZOL试剂使用说明书提取子宫内膜组织总RNA。变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，cDNA合成反应:含有0.5μg/μl Oligo(dT)18 总体积为 20μl的反应体系，逆转录反应条件为65℃ 5min，37℃ 1min，50℃60min，70℃ 15min。所用引物:PRA:F5'-GAGCCCACAATACAGCTTCGAG -3'，R5'-CGAAAACCTCCAAGGACCATG-3';PRB:F5'-GGCAGATGCTGTATTTTGCACC -3'，R5'-CAAACCAATTGCCTTGATGAGC-3'。实时定量PCR反应条件:95℃孵育3min，94℃ 变性 20s，59℃ 退火 20s，72℃ 延伸30s。以GAPDH为内参，用Ct值方法表示mRNA表达的丰度［8］，用 2-△△Ct法分析数据。

1.3.4 免疫组织化学观察 子宫内膜组织常规切片制备成5μm的切片。用苏木精-伊红(HE)染色后，根据Noyes分期标准评价子宫内膜的组织学状态［9］。免疫组织化学所用的PRA一抗为鼠抗人单克隆抗体(滴度为1:200)，PRB一抗为兔抗人多克隆抗体(滴度为1:300)，切片经过脱蜡、复水后用0.1mol/L pH 7.4的PBS冲洗，3%的过氧化氢封闭5～10min。加一抗于4℃孵育过夜，用生物素标记的二抗，链霉素过氧化物酶和DAB检测阳性信号。

1.3.5 免疫组织化学分析 免疫组织化学染色结果采用半定量的 H-score方法进行评分［10］:随机选择10个视野，阳性染色强度以0～3表示，0分为不着色;1分为浅着色;2分为中度着色、深黄色;3分为深着色、棕黄色或咖啡色。着色细胞所占比例0～25%为1分;25% ～50%为2分;50% ～75%为3分;75%～100%为4分。10个视野染色强度和着色细胞占比例乘积的平均值做为该组织的组织化学评分。用SPSS11.5软件包进行统计学分析，采用t检验分析。

2 结果

2.1 一般情况

A型组妇女11例，年龄27.73±2.98岁，不孕年限3.27±0.56 年，月经周期 29.07 ±2.22d;C 型组妇女9 例，年龄28.44 ±2.93岁，不孕年限3.98 ±0.37 年，月经周期 30.22 ±3.15d。两组间比较差异无统计学意义。

2.2 血清E2和P水平

A型组和C型组的E2浓度分别为190.39±5.57 pg/ml和264.88±3.01pg/ml;P浓度分别为17.60±1.17ng/ml和 20.52±1.23ng/ml。两组的E2和P水平均在本中心相应时期的正常值范围，组间比较差异无统计学意义。

2.3 组织形态特征

A型组子宫内膜主要表现为腺腔增大、弯曲、呈锯齿状，腺腔内有分泌物，腺上皮细胞柱状单层排列，位于细胞基底部，顶浆分泌旺盛;间质细胞大且圆，间质水肿明显(图1A)。C型组子宫内膜中可见核下空泡;间质水肿不明显(图1D)。

2.4 RT-PCR 检测

PRB在A型子宫内膜中高表达，在C型子宫内膜中表达量很低，但PRA的表达在两组间没有差异，见表1。

2.5 IHC结果和H-score评分

PRA和PRB主要表达在腺体上皮细胞和间质细胞的细胞核中。PRB的表达在A和C型的间质细胞中有差异，但是腺体细胞中没有差异，见图1C和1F。PRA在腺体和间质细胞的表达都没有明显的差异，见图1B和1E。根据免疫组织化学染色阳性信号的分布和强度，对PRA和PRB染色评分，分别比较间质和腺上皮中的阳性信号，见表1。

图1 子宫内膜HE染色和免疫组织化学染色(×40)

表1 各型子宫内膜不同PR的mRNA表达和H-score评分比较(分，±s)

表1 各型子宫内膜不同PR的mRNA表达和H-score评分比较(分，±s)

*与C组比较P＜0.05

分组 n mRNA表达 H-Score评分腺体 间质9 0.23 ±0.51 3.44 ±3.01 1.11 ±0.40 PRA A 型组 11 2.31 ±0.91 2.62 ±2.31 3.62 ±2.15 C 型组 9 2.46 ±0.82 2.66 ±2.15 2.42 ±2.10 PRB A 型组 11 4.81 ±1.23* 5.27 ±4.62 3.09 ±2.51*C型组

3 讨论

在月经周期中，子宫内膜在E2和P作用下，经历周期性变化，为成熟胚胎的着床做准备。临床根据超声中子宫内膜的回声情况分为A型和C型。有研究观察A型的子宫内膜妊娠的成功率远高于C型［1，2，10，11］。因此阴道超声监测 hCG 日子宫内膜类型对评估内膜容受性、预测临床妊娠结局具有重要意义［1］。但是超声监测下对子宫内膜进行分型的分子依据并不明了。由于hCG日超声分型的结果与E2、P的变化尤其是P的变化紧密相关，故本研究分别观察了PRA和PRB的表达和分布情况，探讨其与超声判断子宫内膜分型中的相互关系。

本研究组织形态学结果显示，在C型内膜中，腺体和基质的发育均不充分，处于滞后状态，少数的腺体中还有核下空泡，呈分泌早期腺体特征;同时分泌中期的重要特征如基质细胞水肿在C型子宫内膜中也不明显。而A型子宫内膜中上皮细胞核下移，腺体发育充分，腺体卷曲且有明显的间质水肿，提示C型的发育比A型滞后。同时，激素测定结果显示，这种基于B超和组织形态学差异的分型与激素水平无关。提示两类型的子宫内膜对P的反应性不同，导致了B超下两种不同类型的子宫内膜表现。

P对子宫内膜细胞的调节作用离不开特异性的PR［3］。PR和P结合后调动PR调控的下游基因启动，从而引发相关的生理变化，使子宫内膜经历一系列的增殖和分化而进入成熟胚胎着床的接受状态。人PR基因位于第8号染色体，成熟的PR分为两个亚型PRA和PRB。二者的差别在于PRB比PRA表达多一段长约164个氨基酸［12］。人月经周期中子宫内膜不同种类的细胞中PR的表达呈周期性变化。上皮细胞中的PRA在增殖期最多，在分泌中期PR在腺体上皮中的表达急剧下降，在基质细胞中的表达增高。为了达到接受胚胎着床的容受状态，子宫内膜细胞对P的调节作出反应，逐渐由增殖状态向分化状态转移，即子宫内膜细胞在P主导下逐步进入接受状态。

本研究中，所有子宫内膜均取材于分泌中期，PRA的表达集中于间质细胞，在腺上皮细胞中表达极低。不同类型子宫内膜中PRA的表达模式一致，经过H-score评分比较后没有差异，提示B超检查结果与组织学表达模式的一致性。PRA的主要功能是调控生殖过程中的排卵、受精和着床等重要环节，PRB的主要功能是介导子宫内膜中各种细胞对P的反应性［13］。A型子宫内膜中PRB无论在RNA水平还是蛋白水平表达均高于C型。这些结果提示PR两种亚型中，PRB亚型主导了间质细胞对P的反应性，在调节PR对P的反应性过程中起关键作用。

综上所述，PRA的表达在A型和C型子宫内膜中没有差别，PRB的表达在A型明显高于C型。免疫组织化学分析和评分发现，这种差异主要存在于间质细胞中。子宫内膜间质细胞对P的反应性是子宫内膜接受状态形成的关键因素。两种PR亚型中，PRB在子宫内膜容受性好的内膜类型中高表达，表明排卵日子宫内膜的超声分型与PRB在分泌中期的表达紧密相关。因此，超声检查分型可预测着床的结局，PRB可能是其分子基础，在子宫内膜容受性评价中起重要作用。PRB如何介导P的反应性，除PRB还有什么因素或调控机制使子宫内膜在排卵日呈现不同的回声状态，及其影响子宫内膜容受性的机制还需要进一步研究。

1 耿琳琳，王宁，王幼劬，等.阴道超声对子宫内膜容受性评估研究［J］.中国计划生育杂志，2012，20(4):253-256.

2 Dechaud H，Bessueille E，Bousquet PJ，et al.Optimal timing of ultrasonographic and Doppler evaluation of uterine receptivity to implantation［J］.Reprod Biomed Online，2008，16(3):368 -375.

3 Sleiter N，Pang Y，Park C，et al.Progesterone receptor A(PRA)and PRB-independent effects of progesterone on gonadotropin-releasing hormone release［J］.Endocrinology，2009，150(8):3833 -3844.

4 Mulac-Jericevic B，Conneely OM.Reproductive tissue-selective actions of progesterone receptors［J］.Ernst Schering Res Found Workshop.2005(52):19-37.

5 Gonen Y，Casper RF.Prediction of implantation by the sonographic appearance of the endometrium during controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization(IVF)［J］.J In Vitro Fert Embryo Transf，1990，7(3):146-152.

6 Anckaert E，Mees M，Schiettecatte J，et al.Clinical validation of a fully automated 17beta-estradiol and progesterone assay(VIDAS)for use in monitoring assisted reproduction treatment［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(8):824 -831.

7 Brugger N，Otzdorff C，Walter B，etal.Quantitative determination of progesterone(P4)in canine blood serum using an enzyme-linked fluorescence assay［J］.Reprod Domest Anim，2011，46(5):870 -873.

8 Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real- time PCR data by the comparative C(T)method［J］.Nat Protoc，2008，3(6):1101 -1108.

9 Noyes RW，Hertig AT，Rock J.Dating the endometrial biopsy［J］.Am JObstet Gynecol，1975，122(2):262 -263.

10 Takasaki A，Tamura H，Miwa I，et al.Endometrial growth and uterine blood flow:a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium［J］.Fertil Steril，2010，93(6):1851-1858.

11 Miwa I，Tamura H，Takasaki A，et al.Pathophysiologic features of"thin"endometrium［J］.Fertil Steril，2009，91(4):998 -1004.

12 蒋蕾，徐望明，扬菁，等.卵泡未破裂黄素化患者子宫内膜中雌、孕激素受体及整合素αVβ3的表达及其意义［J］.中华妇产科杂志，2009，44(12):929 -932.

13 Tranguch S，Smith DF，Dey SK.Progesterone receptor requires a co- chaperone for signalling in uterine biology and implantation［J］.Reprod Biomed Online，2006，13(5):651 -660.

［责任编辑:王丽娜］