犬瘟热及其诊断技术



犬瘟热及其诊断技术

黄二平（浙江省金华市金东区畜牧兽医局 321031） 方远书（浙江省金华市食品药品检验所）

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬的一种高度接触性、致死性传染病。早期双相体温热型，症状类似感冒，随后以支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎为特征。病后期可见有神经症状出现如痉挛、抽搐。部分病例可出现鼻部和角垫高度角化。

本病一年四季均可发生，但以冬春多发。本病有一定的周期性，每三年一次大流行。不同年龄、性别和品种的犬均可感染，但以未成年的幼犬最为易感。纯种犬、警犬比土种犬易感性高，而且病情反应重，死亡率也高。本病最重要的传染源是鼻、眼分泌物和尿液。感染犬瘟病毒的犬60-90d后，尿液中仍有病毒排出，所以说尿液是很危险的传染源，主要传播途径是病犬与健康犬直接接触，也可通过空气飞沫经呼吸道感染。

1 犬瘟热的概述

1.1 临床诊断

临床诊断主要通过本病的流行特点、发病机理、临床特征及类症病的鉴别。

1.1.1 流行特点 在自然条件下可感染多种犬科野生食肉兽，如小熊猫、貉、貂、黄鼠狼，以及豺、狼、獾等。本病一年四季都可发生，冬春季多发。6月龄以内的幼犬特别易感染，症状典型，死亡率极高。世界各地都有流行。

1.1.2 发病机理 感染后病毒主要从鼻咽和呼吸道散布到支气管淋巴结和扁桃体进行原发性增殖，引起病毒血症，病毒分布到全身淋巴器官、骨髓和上皮结构的固有膜。约一半的犬感染后迅速产生抗体，但不出现症状。另一半的感染犬体内病毒继续增殖，广泛侵害多个系统的上皮细胞，而呈现特征性的症状。

1.1.3 临床症状 体温呈双相热型。病初以呼吸道炎症为主，表现为流涕、打喷嚏、咳嗽，常为干咳，严重时鼻镜龟裂，呼出恶臭气体，流脓性鼻液，堵塞鼻孔，张口呼吸呈腹式。肺部听诊，支气管音粗厉，闻干性罗音或湿性罗音或捻发音。可视黏膜发绀，眼睑周围有散性出血点，眼睑干燥，呈脓性眼结膜炎，角膜溃疡，甚至穿孔。若以消化道炎症为主时，主要表现为食欲不振或废绝，呕吐，腹泻，排出带有黏液的稀便，有时带有血液。在后期出现非化脓性脑炎并导致神经症状，流涎，空嚼，体重不断下降，脚垫和鼻过度角质化。有时全身肌肉振颤，转圈，共济失调，口吐白沫，牙关紧闭，最后抽搐而死。

1.1.4 临床类症鉴别 犬瘟热在临床上容易与感冒、呼吸道疾病、胃肠炎、犬细小病毒性肠炎、传染性肝炎等相混淆，根据其临床特征与犬瘟热进行初步鉴别诊断。单纯性胃肠炎时，无双相热型、无鼻、眼分泌物等。传染性肝炎时，有黄疸等。犬细小病毒性肠炎呕吐剧烈、频繁、饮水后立即发生呕吐，渴欲强烈，排出的番茄汁样血便次数多、数量大。感冒时体温升高，无双相热型，鼻流清涕，无流泪现象。而犬瘟热双相热型，眼、鼻有分泌物，严重时有脓性分泌物；病犬饮水后较少发生呕吐，初便秘，后腹泻，粪便稀薄、恶臭，有时混有气泡和血液；鼻、足垫过度角化；末期常出现腹痛、肌肉振颤等神经症状，甚至惊厥直至死亡。

1.1.5 病理变化 本病是一种泛嗜性感染，病变分布广泛。有些病例皮肤出现水疱性皮疹；有些病例鼻和脚底表皮角质层增生而呈角化病。上呼吸道、眼结膜呈卡他性或化脓性炎。肺呈现卡他性或化脓性支气管肺炎，支气管或肺泡中充满渗出液。在消化道中可见胃黏膜潮红。卡他性或出血性肠炎，大肠常有过量黏液，直肠黏膜皱襞出血。脾肿大。胸腺常明显缩小，且多呈胶冻状。肾上腺皮质变性。轻度间质性附睾炎和睾丸炎。中枢和外周神经很少有肉眼变化。

1.2 实验室常规诊断

1.2.1 包涵体检查 包涵体主要存在于膀胱、胆管、胆囊、肾盂上皮细胞内。取清洁载玻片，滴加生理盐水1滴，用小刀在膀胱黏膜上刮取上皮细胞，与生理盐水混合研匀，制成涂片，置空气中自然干燥后，用甲醇固定，苏木精-伊红染色后镜检。细胞核染成蓝紫色，细胞浆呈淡玫瑰色，包涵体被染成红色。包涵体大多在胞浆内，1个细胞内可能含有1~10个多形性包涵体，但一般呈现圆形或椭圆形。分别对用强毒攻毒、注射犬瘟热疫苗和正常狐貉进行检查，结果用强毒攻毒的狐貉发现了膀胱黏膜涂片中有包涵体的存在，而注射犬瘟热疫苗组和正常对照组则无包涵体的存在，对于临床发病动物检查同样可检查出包涵体的存在。

1.2.2 Dot-ELISA法诊断 用建立的三抗体夹心法Dot-ELISA检测犬瘟热病毒(CDV)抗原，其抗原最低检出量为1.15mg/ml(0.57625ng/点)，经与常规ELISA对104份自然感染犬的血液白细胞样本，60份眼结膜分泌物样本，73份脾、肝、淋巴结等脏器样本进行检测，检测的阳性率分别为92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%；两种方法检出的总阳性率分别为83.54%(198/237)和80.17%(190/237)，总阳性符合率为95.96%，表明两者呈高度正相关(r=0.92，P<0.01)。经电子显微镜观察验证比较，三抗体夹心法Dot-ELISA检测的可信度为94.74%。

1.2.3 免疫组化法诊断 免疫组化技术是在抗原抗体特异反应存在的前提下，借助免疫化学的手段，检测抗原(或抗体)在组织细胞内存在部位的一门新技术，目前已广泛应用于人及动物传染病的病原鉴定和快速诊断，极大地提高了传染病的诊断和防治水平。从脑、脊髓、肺、肠、膀胱、脾和淋巴结中均可检出CDV抗原，其中中枢神经系统和肺是诊断的最佳组织，脱髓鞘性脑炎和肺炎是犬瘟热的主要病变。采用过氧化物酶法(PAP)技术检查患犬瘟热性肺炎的病犬组织，认为有病变的脏器组织均可检出CDV抗原，且敏感性明显高于包涵体检查。采用PAP和单抗技术证实实验性感染CDV脱髓鞘性脑炎病犬的脑组织中，不论是脱髓鞘部位还是未见明显病变的白髓的神经胶质细胞中均可见到病毒抗原。阳性细胞包括星状细胞、神经元细胞、室管膜细胞、脉络丛细胞、脑膜细胞和血管周围的炎性细胞。采用免疫荧光(IF)技术研究患犬瘟热性脑炎病犬的CDV分布情况，结果从全部病犬的脑组织中均检出CDV抗原，在灰质和白质中均可见到病变。在灰质中，抗原主要分布于神经元细胞中，包涵体呈成堆的大的颗粒样或细小颗粒状或粉尘样聚集在胞浆中；在白质中主要存在于星状细胞中。采用IF技术证实，在人工感染CDV后3~4d，即可从循环血单核细胞中检出CDV抗原，病犬第一次发热时最具传染性。

1.2.4 犬瘟热病毒的分离和鉴定 （1）病料的采集：采取何种病料，应根据疾病的类型和病情的发展情况而定。在体温开始上升的病毒血症早期，淋巴组织的感染最为严重，因此最好从淋巴细胞和淋巴组织分离病毒。对于急性病兽或急性死亡动物，病毒分布于全身各器官，故应从脏器中分离病毒。在慢性病例或疾病的中后期多从肾脏或脑组织分离病毒。（2）病毒分离：犬瘟热病毒能够适应鸡胚和多种组织细胞培养物，但并非所有毒株都能生长良好。犬瘟热病毒通过绒毛尿囊膜接种9~11日龄鸡胚，经3~10代后，于接种后5~7d绒毛尿囊膜增厚，有的可引起豆斑。有报道认为，分离犬瘟热病毒最好的方法是用犬和貂的巨噬细胞培养物，接种2~3d后出现圆形多核巨细胞。巨细胞容易脱落，而且并非所有的细胞都形成巨细胞，故应多次仔细观察。（3）病毒的鉴定：通过电子显微镜检查、酶标SPA染色和琼脂扩散试验等方法进行病毒鉴定。电镜下观察可见犬瘟热病毒粒子呈现多形性，多数为球形，病毒粒子的直径为110~550nm之间。核衣壳呈螺旋状，总长度为1000nm，螺旋直径15~19nm，螺旋中心5nm的孔，螺距5~6nm，核衣壳由囊膜包裹，其内部为M，厚约5nm，表面为H和F两个糖蛋白组成的纤突，纤突长度为9nm。应用酶标SPA(葡萄球菌A蛋白)染色法对接种CDV的Vero细胞进行染色后发现，有相应CDV抗原部位，同样滴加CDV阳性血清的对照细胞片，未见相应反应。CDV MD-77株感染后3、6、9、12h，胞浆可见细小阳性颗粒(呈淡黄色至棕褐色着染)；1d后阳性反应明显增强，多见于胞浆，胞浆亦可见大空泡；2d后坏死细胞呈强阳性反应，细胞间拉网；3~4d后合胞体细胞呈强阳性反应，坏死细胞呈棕褐色至黑褐色；5d后阳性反应主要见于新生细胞胞浆；6d后合胞体细胞呈大圆形，阳性反应主要见于胞浆；7d后整个合胞体细胞呈一棕褐色大团块；8d后大部分细胞脱落，残留细胞呈强阳性反应。利用犬瘟热鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫动物制备琼脂扩散抗体，并对患犬瘟热病貉肝脏中的抗原进行检测，与电镜结果相比较，阳性符合率达85.7%，阴性符合率为75%，认为是一种较为特异、敏感、操作简便的方法。

1.2.5 分子生物学诊断 随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学的进步，大大提高了病毒的诊断水平，特别是核酸杂交、PCR技术的应用，大大提高了疾病诊断的准确性、敏感性和特异性。直接从死亡大熊猫肝脏提取细胞总RNA，经反转录后用犬瘟热病毒的1对引物扩增出了约320bp的片段。此产物经纯化、序列分析表明，其片段2个引物间长度为281bp，与预计片段大小相同。此毒株在核苷酸和氨基酸水平与北京犬野毒株、哈尔滨犬野毒株、某疫苗弱毒株、Onderstepoort弱毒株和海豹瘟热病毒2型毒株的同源性分别为92.2%和98.9%、92.5%和98.9%、91.5%和94.6%、92.9%和98.9%、98.2%和100%。这样就进一步确定了大熊猫的犬瘟热病毒感染。用地高辛标记Ｎ基因互补的特异性RNA探针具有高度敏感性，可查证单个感染细胞中存在的目的核酸序列，特异性较强，不产生背景。运用RT-PCR已能检测出患狗外周血单核细胞中的犬瘟热病毒的核衣壳蛋白基因(N)及运用pRVSV载体成功表达了CDV的N基因。

目前，在兽医临床工作中，犬瘟热的诊断多采用临床诊断、包涵体检查和ELISA法。对于病毒的分离、鉴定，免疫组化法和分子生物学等诊断方法，尚未推广应用。

2 典型病例诊治

2.1 发病情况

2011年12月20日，金东区曹宅镇杜某家的牧羊犬4月龄，咳嗽，拒食，呕吐，粪便中混有血样黏液，主人带狗来本处求诊。

2.2 诊断情况

经问询主人得知，该犬于11月初购于市区一宠物市场，之后一直养在自家，未进行过任何疫苗免疫，12月17日开始出现咳嗽。经检查，该犬精神沉郁，眼角有跟眦，鼻部流有黄色脓性分泌物，打喷嚏，不愿活动，体温为40℃，且呈双相热，粪便中混有血样黏液。经流行病学调查和临床症状观察，初步诊断为犬瘟热。

2.3 实验室检查

包涵体检查：细心刮取支气管黏膜上皮细胞涂片、自然干燥，用甲醇固定，苏木紫—伊红染色，镜检，在上皮细胞的胞浆或胞核内可见呈圆形或卵圆形、直径1~2μm、呈红色的包涵体。

2.4 治疗

2.4.1 血清疗法 使用犬瘟热高免血清，2ml/kg体重皮下注射3d，做好紧急被动免疫。

2.4.2 对症治疗 用地噻米松5~20mg肌肉注射，1次/d，具有消炎和解热作用；大量饲喂VB和VC，选用强心剂、利尿剂及收敛、止吐药和止咳祛痰药静脉注射等。

2.4.3 控制继发感染 为防止和控制继发感染，按静脉注射氨苄青霉素20mg/kg体重，肌肉注射。

2.4.4 转归情况 由于病情发现的较早，并得到很好的诊治，一段有效的治疗时间后，病情好转。犬完全恢复后，按程序进行犬七联苗的免疫，做好预防保健工作。

3 防制措施

3.1 免疫

定期预防接种是预防发生犬瘟热的有效途径。据笔者经验，注意以下几点：（1）采用正规厂家生产的疫苗，尽量使用联数少的。犬瘟热一细小病毒二联苗从感观上比五联、六联苗有效的多(尚未进行完全统计)，笔者曾用人用麻疹疫苗对7只未断奶犬和4只断奶犬进行首免，免疫剂量为1.5~2头份，20d后用犬用五联苗二免，二免后3个月用五联苗三免，至今已6~7月龄，未发生犬瘟热。（2）美国兽医学会曾建议，免疫状态不明的3月龄以下犬只应给两剂或三剂以上疫苗。应对断奶犬用二联或五联苗首免，免疫剂量2~3头份，隔3周后二免，12~16周时三免，剂量为1头份或2头份。以后每年接种一次五联疫苗。（3）改变接种途径。文献记载，静脉或肌肉注射疫苗免疫产生快、效果好，皮下接种免疫产生慢且不确实。因此，最好采取肌肉接种方法。

3.2 自繁自养

加强兽医卫生防疫措施各养殖杨应尽量做到自繁自养。个人养的犬，在本病流行季节，严禁将犬带到犬集结的地方。

3.3 隔离

及时隔离治疗发现病犬，要及时隔离治疗，防止扩大传播。目前尚无特异的有效疗法。发病早期可应用本病康复犬血清或全血进行肌肉或皮下注射，剂量为血清4~5ml，全血10~15ml，有一定疗效。此外，早期应用抗生素(如青霉素、链霉素等)，并配合对症治疗，对于防止细菌性继发感染和病犬康复有重要的意义。

3.4 消毒

用3%烧碱溶液或10%福尔马林彻底消毒犬舍、运动场地。

（2012–08–09）

S858.292

B

1007-1733(2012)11-0029-03