薯蓣皂素对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移的影响

李 印，宋秀胜

恩施自治州中心医院眼科中心(湖北 恩施 445000)

人视网膜色素上皮(RPE)细胞增生、迁移，细胞外基质成分 ( extracellular matrix, ECM )的异常沉积是增生性玻璃体视网膜疾病(PVR)发生和发展的重要环节[1]。研究表明，RPE细胞在PVR的发展中起着最重要的作用。为了寻找有效的抗PVR的药物，我们探讨薯蓣皂素(Diosgenin)对体外培养的人RPE-19细胞系的增殖、迁移的影响。薯蓣皂素是一种存在于多种植物(如葫芦巴、野薯蓣的根)中的甾体皂素[2],是甾体激素的前体物质,具有抗高脂血症、维持血管内胆固醇水平、抗血小板聚集及抗氧化作用[3,4,1-4]。薯蓣皂素还能通过上调环氧合酶-2和脂氧合酶的活性而起到诱导细胞凋亡作用[5-7]，抑制巨噬细胞源性的炎性介质,可用于免疫抑制治疗[8],因此薯蓣皂素可作为疾病的细胞和分子靶向治疗的药物。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，薯蓣皂素(日本东京化成工业株式会社),CO2培养箱(美国Forma公司),Transwell小室购自Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代:ARPE-19细胞系由武汉大学细胞库中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购得, 细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中, 置于37 ℃、5% CO2的孵育箱中培养。 细胞生长融合后用0.25%的胰蛋白酶以1∶2的比例消化传代。

1.2.2 实验分组:对照组和含不同浓度药物的实验组作用于ARPE-19细胞：对照组，含10%PBS的DMEM/12培养基中不加入任何药物，即药物浓度为0 μg/ml；实验组，将药物浓度依次设5,10,20,30,40,50,60,70 μg/ml，以每并列5个孔为一组，实验重复3次。根据MTT结果确定薯蓣皂素的安全浓度范围。

1.2.3 MTT法检测不同浓度药物对RPE细胞增生活性：采用MTT比色法将ARPE细胞正常传代计数,调整细胞密度为104个/100 μl，接种于96孔板中，每孔100 μl细胞悬液。空白组，孔内加入100 μl DMEM/F12培养基，不含细胞。实验组，将不同浓度的药物(5,10,20,30,40,50,60,70 μg/ml)加入细胞孔内，对照组加入相同体积的PBS，每组设复孔，37℃、5% CO2的孵育箱中培养过夜。加药培养24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 10 μl, 37 ℃培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，使紫色结晶溶解。选择570 nm测定各孔光吸收值(OD值)。重复实验3次。细胞抑制率=1-(实验组OD值/ 对照组OD值)×100%。

1.2.4 Transwell小室检测细胞测迁移变化：采用直径为8.0 μm的Transwell小室进行细胞迁移能力的检测。常规培养传代后，取1×105个细胞加入EP管内，实验组加入安全浓度的薯蓣皂素(依据MTT结果，浓度分别为5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)，对照组加入同体积的PBS，混匀后加入Transwell上室内，在小室的下层加入400ul含相应浓度薯蓣皂素的10% PBS的DMEM/F12培养基，于常规条件下继续培养18 h。 取出Transwell，用棉签擦去多聚碳酸酯滤膜上层的细胞，下层细胞用结晶紫染色，在100倍光学显微镜下每张膜随机观察5个视野并计数，实验重复3次。每组迁移细胞数为15个视野的平均细胞数, 按照以下公式计算抑制率。 抑制率 = (阴性对照组平均迁移细胞数-实验药物组平均迁移细胞数)/阴性对照组平均迁移细胞数×100%。

2 结果

2.1不同浓度薯蓣皂素对RPE细胞增殖的抑制作用不同浓度薯蓣皂素(5,10,20,30,40,50,60,70 μg/ml)分别作用于培养的ARPE-19细胞24 h后，与对照组相比，对细胞增殖的抑制率依次为21.3%、52.8%、79.0%、82.2%、85.1%、87.3%、96.8%、99.2%(见图1)。图1中可以看出30 μg/ml以下浓度对细胞的增殖抑制有统计学意义(P<0.05)，30 μg/ml及以上各浓度组薯蓣皂素对RPE细胞的抑制到达平台期，各浓度梯度间无统计学意义(P>0.05)，且试验中可见从30 μg/ml起显微镜下观察细胞有死亡碎片及悬浮细胞，至60，70 μg/ml时细胞大部分死亡。20 μg/ml及以下对RPE细胞的增殖具有抑制作用(P<0.05)且对细胞无毒性，为安全浓度范围，故而在后期试验中选择20 μg/ml为节点。安全浓度范围内(0～15 μg/ml)，薯蓣皂素作用48 h组与24 h组无显著差异(图2)。

图1 不同浓度薯蓣皂素作用于ARPE-19细胞24 h后对细胞的增生抑制作用

图2 安全浓度范围内薯蓣皂素48 h和24 h对RPE细胞的增殖抑制作用

2.2薯蓣皂素抑制RPE细胞迁移不同浓度的薯蓣皂素处理细胞18 h后,Transwell迁移能力测定显示实验组迁移过滤过膜的细胞数显著低于对照组(325±64，206±84,124±46 vs 498±78,P<0.05,见表1)，且随浓度增加迁移抑制作用增强。

表1 MTT实验显示不同浓度的薯蓣皂素对RPE细胞迁移的影响

3 讨论

PVR是多种细胞及细胞因子参与的对眼内损伤的过度修复反应，是牵拉性视网膜脱离及视网膜脱离术后复发主要的原因。细胞的增生、迁移是PVR发病的早期分子机制。视网膜色素上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、Müller细胞参与PVR的进展，这些细胞在视网膜表面和玻璃体腔的增生和迁移，分泌合成胶原等多种细胞外基质，在视网膜前膜或下膜之间形成可收缩的增生膜，膜的收缩导致牵拉性视网膜脱离，最终导致失明[9]。RPE细胞在PVR的发展中起着决定性的作用。通过抑制RPE细胞迁移、增生从而阻止膜的形成是治疗PVR的方向之一。

薯蓣皂素作为一种甾体激素的前体物质，作为抗炎药物应用于多种体外实验。本实验中，通过配置不同浓度薯蓣皂素作用于RPE细胞，了解其对RPE细胞的毒性及安全浓度范围，在安全浓度范围内，随着薯蓣皂素浓度的增加，细胞的增殖作用逐渐减弱，且作用48 h与作用24 h的结果无显著差异，说明该浓度物质对细胞是安全的。在确定了安全浓度后，又通过Transwell迁移实验，进一步了解该物质对RPE细胞迁移能力的影响，实验结果表明随着薯蓣皂素浓度增加，RPE细胞的迁移能力逐渐下降，说明该物质可以抑制RPE的迁移。

体外实验证明薯蓣皂素对RPE细胞的增殖和迁移具有抑制作用，而且安全有效，从而有可能成为一种新抗炎药，用于治疗RPE细胞增殖迁移导致的相关玻璃体视网膜疾病。

[参考文献]

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