CCK-8和M TS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较①

刘艳秋，张可华，王运良，舒峻，来薛，吴立群，曹善霞，李鸿，徐扬，高艳，崔晓惠，左和鸣，蔡哲

CCK-8和M TS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较①

刘艳秋1a,2，张可华1a，王运良2，舒峻1a，来薛1a，吴立群1b，曹善霞1b，李鸿1a，徐扬1b，高艳1b，崔晓惠1b，左和鸣1a，蔡哲1a

目的 探讨CCK-8、MTS两种不同的四唑盐试剂在羊膜上皮细胞增殖检测中的最适实验条件，并比较两者细胞毒性。方法取体外培养对数生长期羊膜上皮细胞，用完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)配制成不同浓度的细胞悬液加入96孔板中培养24 h，分别加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波长处测定光密度(OD)。在同一细胞浓度下，根据同一波长不同时间检测的OD确定CCK-8的最佳孵育时间。取体外培养的对数生长期羊膜上皮细胞分别用DMSO、CCK-8、MTS处理1 h、2 h、3 h和4 h后，继续培养24 h，在450 nm处以CCK-8检测细胞增殖，并通过台盼蓝染色计数活细胞数。结果CCK-8法的最佳波长为450 nm，MTS法的最佳波长为492 nm。CCK-8法灵敏度稍低于MTS法。1～4 h内，CCK-8试剂与待检测细胞最佳孵育时间为4 h。CCK-8法对细胞增殖影响及细胞毒性均小于MTS法。结论CCK-8法是一种更为方便、细胞毒性作用较小的试剂。

MTS；CCK-8；羊膜上皮细胞；细胞增殖；细胞毒性

[本文著录格式]刘艳秋，张可华，王运良，等.CCK-8和MTS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较[J].中国康复理论与实践, 2012,18(9):827-830.

人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)是胎盘羊膜组织靠近胎儿侧的单层上皮细胞，来源于胚外外胚层。研究表明，hAECs内含多种干细胞样细胞和前体细胞，具有明显的可塑性和多分化潜能[1]。我们的实验发现，hAECs具有神经干细胞样特征，并且部分hAECs具有成熟多巴胺能神经元细胞的标志蛋白和分泌多巴胺的特性。hAECs无致瘤性，低免疫原性，系产后废弃物，不涉及社会伦理学和生命伦理学问题。基于上述优点，hAECs成为细胞移植治疗神经退行性疾病以及中枢神经系统损伤的潜在候选细胞。

从羊膜分离的hAECs可在体外进行传代培养，最多可传代至6代以上。随着传代次数增加，细胞的增殖活性随之下降[1]。另外，不同培养条件对hAECs增殖也影响甚大。临床细胞移植需要建立稳定可信的hAECs增殖活性检测方法，因此实验中常常需要hAECs的增殖检测。自1983年M osmann建立MTT比色法[3]以来，由于其经济、无放射性污染等特点，被大多数研究者用于细胞生长增殖及活性的检测[4-5]。但其在操作过程中需加入二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜颗粒，且往往溶解不全而对实验结果造成影响。近年来，国外研发出两种新型的检测方法：CCK-8法和MTS法[6-7]，其原理为活细胞线粒体脱氢酶转化的黄色结晶为高度水溶性，不需要裂解细胞，可直接进行比色[8]。两种方法步骤简便，且准确性得到提高。由于hAECs属于原代细胞，与大多数建系细胞株代谢特点和增殖活性有所不同，因此在检测增殖时需要对各项实验条件和参数进行有针对性的优化。

图1 在波长450 nm下细胞浓度与OD的关系

图2 在波长492 nm下细胞浓度与OD的关系

图3 在敏感波长下CCK-8和M TS法OD比较

图4 CCK-8不同孵育时间下OD比较

图5 不同试剂下细胞OD(用CCK-8测定)

图6 不同试剂下细胞形态(台盼蓝染色，40×)

1 材料与方法

1.1 材料 CCK-8试剂：日本同仁化学公司；MTS试剂：PROMEGA公司；DMSO试剂：GIBCO公司；0.4%台盼蓝染色：GIBCO公司；96孔板：COSTAR公司；MK 3型酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司；倒置显微镜：OLYMPUS公司；hAECs：中日友好医院临床研究所免疫室传代保存。

1.2 方法

1.2.1 最佳波长 将对数生长期hAECs以每孔不同的细胞数(1×103、2×103、5×103、10×103)接种于96孔培养板中，平行接种2组，设3个复孔；每孔加完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，每孔换成DMEM/F12培养基100μl，一组每孔加入CCK-8试剂10μl，另一组每孔加入MTS试剂20μl，培养箱中孵育4 h。两组分别在波长450 nm和492 nm下，用酶标仪检测培养细胞的光密度(OD)。

1.2.2 灵敏度 前组细胞中，加入CCK-8的在450 nm波长条件下检测吸光度，加入MTS试剂的在492 nm波长条件下检测吸光度，比较细胞数目不同时两种检测方法检测的OD。

1.2.3 CCK-8共同孵育时间对检测结果的影响 将对数生长期的hAECs以每孔5×103接种于96孔培养板中，设3个复孔，每孔完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；每孔换成DMEM/F12培养基100μl，分别加入CCK-8试剂10μl，再孵育1～4 h。450 nm波长酶标仪分别检测共同孵育1 h、2 h、4 h时OD。

1.2.4 细胞毒性 将对数生长期的hAECs以每孔5×103接种于96孔培养板中，平行接种10组，设3个复孔，每孔完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，换成DMEM/ F12培养基100μl。阴性对照组不加任何试剂，阳性对照组加入DMSO试剂10μl，另外两组分别加入CCK-8试剂10μl、MTS试剂20μl，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养1 h、2 h、3 h和4 h后，换成新鲜DMEM/F12培养液100μl，继续于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。加入CCK-8 10μl，放置4 h后酶标仪450 nm波长下分别检测各组细胞的增殖状态。每孔培养液换成PBS 100μl，加入0.4%台盼蓝染色试剂5 μl，室温放置5m in，倒置显微镜下观察。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件对数据进行Student-t检验，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 最佳波长 在细胞孵育时间相同的条件下，加入CCK-8与加入MTS的细胞OD都随着细胞数的增加而增加。CCK-8在波长450 nm处随细胞数增加，OD上升幅度更大，而MTS在波长492 nm处上升幅度更大(图1、图2)。CCK-8敏感波长为450 nm，MTS为492 nm。

2.2 灵敏度 在CCK-8和MTS各自敏感波长下检测，随着培养细胞数量的增加，OD均增加，相同细胞浓度下，MTS测量到的OD均略高于CCK-8(图3)。

2.3 CCK-8与hAECs最佳共同孵育时间 CCK-8与培养细胞共同孵育，随时间延长，OD逐渐增加(P＜0.001)(图4)。

2.4 细胞毒性 在波长450 nm处，DMSO组OD低于阴性对照组(P＜0.05)，CCK-8组各时间点与阴性对照组无显著性差异(P＞0.05)，MTS组2 h、3 h时OD呈明显下降趋势，且各时间点OD均低于阴性对照组(图5)。

台盼蓝染色观察，DMSO组细胞收缩变小，均发生蓝染；MTS组部分细胞收缩并蓝染；CCK-8组和阴性对照组细胞形态相似，无蓝染细胞(图6)。

3 讨论

鉴于hAECs对神经系统退行性疾病的潜在治疗作用和应用前景，对hAECs的增殖、分化、成瘤性等细胞学鉴定十分必要。

在细胞学研究领域，用于检测细胞活性及增殖的方法主要有3H-TdR掺入法和MTT比色法。3H-TdR掺入法虽然灵敏度高、特异性强、稳定性好，但由于操作步骤多、存在放射性危害等限制了其使用。

MTT法的作用原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物；当活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲臜，加入二甲基亚砜(DMSO)将结晶的甲臜溶解释放，再用酶联仪测定吸光度OD。此法与3H-TdR掺入法比较具有操作简便、无污染的特点。但需加入DMSO溶解才能比色，因此略显繁琐，且操作不当会给实验带来极大误差。

近年来开发的四唑盐，如MTS、CCK-8等可替代MTT法检测细胞增殖。CCK-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-M ethoxy PMS)的作用下，被细胞中的乳酸脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料，生成的甲臜量与活细胞数成正比，且甲臜量可用酶标仪测定吸光度来衡量，利用此原理可进行简便而准确的细胞增殖和活性分析[9-14]。MTS试剂由一种新型甲臜化合物2-对磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐(MTS)和一个电子偶联剂(吩嗪硫酸二甲酯)PMS组成。活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶性甲臜化合物，甲臜化合物的量与培养基中活细胞数成正比，且甲臜的量可用酶标仪测定吸光度来衡量。与MTT相比，CCK-8、MTS可直接进行比色，实验步骤简便，也大大提高了实验的敏感性，并且避免了DMSO对细胞的不良影响[15]。

本研究探讨MTS、CCK-8在hAECs增殖检测中的灵敏度、最佳波长、最适孵育时间，并且首次比较和探讨了MTT、MTS和CCK-8对细胞的毒性。曾有实验证明，在细胞浓度1.25×103～1.6×105/孔范围内，CTLL-2细胞的活细胞数与OD450之间呈线性相关[16]。在本组实验中，加入CCK-8试剂的hAECs，在2×103～10×103/孔范围内，活细胞数与OD450值也呈线性关系；而MTS组细胞孵育一定时间后，OD虽然也随细胞数的增加而增加，但线性关系与CCK-8相比稍差。

本实验结果显示，对于hAECs的增殖测定，MTS法灵敏度略高于CCK-8法，两种方法均快速、操作简便。由于MTT法需加入DMSO溶解甲臜颗粒，DMSO具有比较强烈的细胞毒性，DMSO组hAECs孵育4 h后出现固缩，台盼蓝可染成蓝色，表明可能发生细胞凋亡或坏死。MTS组hAECs孵育4 h后细胞增殖受到抑制，但细胞形态无明显变化。CCK-8组 hAECs，细胞增殖及形态均无明显变化。表明CCK-8的细胞毒性在同类试剂中最小。

综上所述，CCK-8和MTS均能较好检测hAECs的体外增殖。相对于MTS法，CCK-8法是一种更经济、细胞毒性作用较弱的检测试剂，值得推广使用。

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Com parison of Experim ental Conditions of CCK-8 and M TS for Hum an Am niotic Epithelial Cells Proliferation Assay

LIU Yan-qiu,ZHANG Ke-hua,WANG Yun-liang,etal.Department of Immunology,Institute ofClinicalMedicine,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Ob jectiveTo explore the optimal experiment conditions of CCK-8 and MTS for cell proliferation assays in human amniotic epithelial cells and to evaluate the cytotoxicity of these reagents.M ethodsHuman amniotic epithelial cells(hAECs)in logarithm grow th stages were prepared in different cell concentrations w ith DMEM/F12 and 10%FBS.The sensitivity and optimalwavelengths was determ ined based on the optical density(OD)measured at 450 nm and 492 nm.The optimal time was determ ined under the conditions of the same cell concentration and defined OD values.HAECswere treated w ith DMSO,CCK-8 and MTS for 1 h,2 h,3 h,and 4 h,respectively. 24 h later,cytotoxicity of the CCK-8 and MTSwas evaluated by determ ination of cell proliferation and Trypan Blue staining.Resu ltsThe optimal detection wavelength was 450 nm for CCK-8,and 492 nm for MTS.The sensitivity of CCK-8 was slightly lower then thatof MTS. The optimal time for incubation hAECs w ith CCK-8 was 4 h w ithin 1～4 h.The inhibitory on cell proliferation and cytotoxicity of CCK-8 were weaker then those of MTS.ConclusionCCK-8 is a convenient reagent w ith low cytotoxicity for detection of the proliferation of hAECs.

MTS;CCK-8;amniotic epithelial cells;cell proliferation;cytotoxicity

R446.61

A

1006-9771(2012)09-0827-04

2012-04-25

2012-04-27)

1.中日友好医院，a.临床医学研究所免疫学研究室；b.妇产科，北京市100029；2.中国人民解放军第148中心医院神经内科，山东淄博市255300。作者简介：刘艳秋(1984-)，女，山东淄博市人，硕士研究生，医师，主要研究方向：神经病学。通讯作者：蔡哲。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.010