以长白猪为受体母猪生产克隆五指山小型猪的妊娠诊断

王 伟，崔成哲，李秀元，王晓明，尹熙俊，李文学＊

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133002；2.延边农业科学院，吉林龙井 133400）

目前，克隆猪技术在我国已经取得了很大的进展，克隆猪研究可以为家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础。其中克隆猪的妊娠诊断是克隆猪技术中的一个关键技术，如果能在早期判断母猪已经受孕，可按妊娠母猪进行饲养管理，如未受孕要采取措施，促使母猪再次发情配种，防止形成空怀母猪，造成饲料浪费［1］。另外，在克隆胚着床后全程监测的过程中发现，怀孕子宫的扩张情况并不大，比正常配种怀孕的子宫扩张要小得多，临床实时超声扫描中发现有的胎儿无胎动，有个别胎儿外型轮廓看不清。表明克隆胚的体内发育较正常受精卵要差，个别胎儿发育异常［2］，妊娠后期可能由于胎儿畸形、发育不良、死亡、退化、吸收等原因而导致B超检测为阴性，故有必要应用B超联合猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行妊娠检测。

目前对于五指山小型猪，特别是克隆五指山小型猪的妊娠诊断的研究还较少，并且标准不一，指压法不易实现，准确率低。所以，本试验采用B超联合猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行妊娠诊断，以期确定克隆五指山小型猪早期妊娠诊断的适宜时间，为克隆五指山小型猪受体妊娠诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 吉林省龙井市农业科技研究所猪场自然发情的长白母猪为受体母猪共24头，编号采用原猪场的耳号。

1.1.2 实验器材及主要试剂 50STringa VET便携式兽用B超诊断仪，荷兰PIE MEDICAL公司产品；猪早孕检测试盒，龙岩蚨瑞生物科技有限公司产品。

1.1.3 移植的胚胎 移植的胚胎为五指山小型猪2细胞～4细胞期克隆胚胎，克隆胚胎的构建在吉林省转基因动物与胚胎工程重点实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 克隆胚胎移植 2011年5月28日－8月31日，胚胎移植采用手术方法将克隆胚胎移植到受体母猪一侧或双侧输卵管，单侧输卵管移植150枚～200枚克隆胚。

1.2.2 妊娠检测 采用B超联合猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行妊娠检测。

1.2.2.1 B型超声妊娠检测法 胚胎移植后第22天开始进行妊娠检测，每周进行一次检查直至分娩。探测部位可选择在受体母猪的最后一对乳头的腹部两侧，用手指状突阵探测头频率为3.5MHz进行扫查诊断。探头与体轴平行朝向母猪的泌尿生殖道进行滑动扫查或扇形扫查。探到膀胱后，向膀胱上部或侧面扫查。妊娠超过1.5月后探查的位置逐渐前移，并且扫查方向也由向后变为向前［3］。

1.2.2.2 猪早孕检测试剂盒进行妊娠检测 试剂盒采用间接竞争ELISA法，收集移植（移植当天为0 d）后26d～32d或66d之后的受体母猪尿液用于检测，用酶标仪进行数字化显示以得出检测的详细结果，检测严格按照说明书上的检测区间进行。

猪早孕妊娠检测试剂盒检测结果中，参比对照组C1值大于C2值，说明检测试验成功，待检样品A值大于C1值判为阴性，表明待检母猪未妊娠；待检样品A值小于C1值判为阳性，表明待检母猪已妊娠；待检样品A值在C1值和C2值之间判为可疑，应稍后再取样进行重测。

2 结果

2.1 受体母猪B超妊娠检测结果

克隆胚胎移植受体B超妊娠检测结果表明，受体母猪在30d的妊娠率为45.83%（11／24），从后期结果来看，30d确诊阳性准确率为100%（11／11），检出率为91.67%（11／12）。由检测图片可以看出，在胚胎移植后30d（图1），可以检测到孕体和胎体反射；52d（图2）可以检测到胎儿的数量、胎儿骨骼及头部和脊柱；8 7d（图3）可检测到胎动。另外，0126号和0139号受体母猪在早期妊娠诊断中结果为阳性，但分别在59d和66d进行B超检测时结果显示为阴性，故有必要应用猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行进一步的妊娠检测。

图1 妊娠30d的B超影像图，箭头所示为孕体Fig.1 Real－time B－mode ultrasound image of a 30days fetus，the arrowhead shows the conceptus

图2 妊娠52d的B超影像图，箭头所示为胎儿脊柱Fig.2 Real－time B－mode ultrasound images of a 52days fetus，the arrowhead shows the fetal vertebral column

图3 妊娠87d的B超影像图，箭头所示为胎儿心脏，在检测时看到明显的胎动Fig.3 Real－time B－mode ultrasound images of a 87days fetus，the arrowhead shows the fetal heart，the obvious fetal movement is detected

2.2 猪早孕妊娠检测试剂盒检测结果

猪早孕妊娠检测试剂盒检测结果见表1。

表1结果显示除0139号和0126号外，09号未妊娠，其余全部妊娠。其中，45号、09号、177号为胚胎移植后26d～32d范围内的检测结果，检测结果与B超检测结果完全一致；37号、3464号、39号、0139号、和0110号为胚胎移植后66d以上的检测结果，0126号前后两个结果分别为29d和66d测得。除了0139号结果跟B超检测结果不一致以外，其余结果全部一致（包括表中未列出的数据），但是0139号在胚胎移植后29d和67d检测结果为阳性，74d发现母猪有发情迹象，79d进行了第2次试剂盒检测结果转为阴性。

2.3 分娩情况

截止2011年12月22日，11头受体母猪妊娠，其中受体母猪成功分娩出67头克隆五指山小型猪，受体母猪产仔率为6只／头，图4为克隆仔猪正在哺乳的场景。新生仔猪因各种原因死亡22头，死亡率为32.84%。

图4 哺乳的克隆仔猪Fig.4 cloned suckling piglets

表1 猪早孕妊娠检测试剂盒检测结果Table 1 The test results of early pregnancy diagnosis kit

3 讨论

目前，对母猪进行妊娠检测的方法有很多，包括指压法、碘化法、观察法、试剂盒检测法以及仪器检测法等，常规早期妊娠诊断方法对于第一情期配种后不发情而又未孕（占配种头数20%左右）的母猪，一般需待到配种后40d～80d左右才能比较有把握地确诊是否怀孕。另外，有的经产母猪由于上一个妊娠周期的黄体在配种后20多天仍然存在，导致母猪未受孕但不发情，这又容易造成妊娠诊断中的误诊，甚至造成更大的经济损失。

超声波妊娠诊断技术［6］近年来广泛应用于猪的研究中，在国内外报道较多［2－4］，但是关于克隆猪的妊娠诊断的报道相对较少，并且标准不一。本研究使用50STringa VET便携式兽用B超诊断仪联合猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行妊娠检测。妊娠早期检测结果基本一致，后期除了0139号检测结果不一致，其余结果全部一致，这说明B超联合猪早孕检测试剂盒用于克隆五指山小型猪的妊娠检测是非常有意义的。本试验中B超检测结果表明，受体母猪在30d的妊娠率为45.83%（11／24），从妊娠后期及分娩结果来看，30d确诊阳性准确率为100%（11／11），检出率为91.67%（11／12），妊娠率低于王少华等［2］的研究结果（30d妊娠率为66.67%（2／3），30d阳性准确率为100%），原因可能是由于王少华等研究的样本数太小造成的。本研究中，确定克隆五指山小型猪早期用B超进行妊娠诊断的最佳时间为胚胎移植后30d，结果与Knox R［3］的结果一致（24d～35d），但与田超等［5］的研究（22d）相比，妊娠诊断时间要晚8d；可以准确检测怀胎数的时间，与王少华等［2］的结果相比基本一致（52dvs 50d），但与邓立新等［1］的结果相比明显要晚（52d vs 28d～35d）；能够检测到胎动的时间为胚胎移植后87d，与冯现明等［7］的结果（40d）相比要晚47d，但比王少华等［2］的结果相差不多（87dvs 90d）。原因可能是由于除王少华之外，其他研究者检测的是普通母猪的正常妊娠过程，而本实验研究的是克隆五指山小型猪以长白猪为受体母猪的妊娠过程，受体母猪的品种、仔猪的品种、胚胎的获得途径和方法都有明显的区别造成的，另外，0110号曾在胚胎移植后44d和52d时B超检测结果呈阴性，但在后期B超检测结果转为阳性（与试剂盒检测结果一致），可能是由于克隆猪的胚胎发育过程与正常猪也存在一定的差异，在克隆胚胎着床后，随着胚胎的发育，怀孕子宫比正常配种怀孕的子宫扩张小。另外，王少华等［2］发现在B超检测中发现有的胎儿无胎动，个别胎儿外型轮廓看不清，表明克隆胚的体内发育较正常受精卵要差，个别胎儿发育异常。故在克隆猪的早期妊娠诊断过程中，很可能由于克隆胚在受体母猪体内发育不良而影响B超检测结果，从而推迟早期应用B超进行猪的妊娠检测［8］的最佳时间。

猪早孕妊娠检测试剂盒的检测结果表明，猪早孕妊娠检测试剂盒用于猪的妊娠检测结果具有很高的准确性，其中0139号在胚胎移植后67d检测结果为阳性，在74d发现母猪有发情迹象，在79d进行了第二次试剂盒检测结果转为阴性。可能是由于妊娠后期胎儿畸形、发育不良、死亡、退化、吸收等原因而造成的，猪早孕妊娠检查试剂盒的检测结果具有很高的准确性，而且应用方便，快捷，为猪早期妊娠诊断提供了新的途径和方法。故有必要应用B超联合猪早孕检测试剂盒对受体母猪进行妊娠检测。

从受体母猪分娩情况可以看出，受体母猪的产仔率仅为6（67／11）只／头，比较受体母猪的平均产仔率明显偏少；新生仔猪死亡率为32.84%，明显偏高。其原因可能是早期克隆胚胎重新程序化异常，致使胚胎发育过程中出现呼吸系统缺陷、循环系统缺陷、免疫缺陷或肾脑功能缺损等，导致胚胎早期死亡以及死胎、弱胎增多有关，如何提高受体母猪的产仔率以及降低新生仔猪的死亡率有待进一步研究。另外，受体母猪的某些疾病以及新生仔猪的疾病也会影响产仔率和仔猪死亡率，因此，加强产后受体母猪和仔猪的护理也很重要［9］。

母猪妊娠监测是非常有意义的。B超用于克隆猪的妊娠检测能够及时地诊断出母猪子宫的妊娠变化，包括胎动、胎儿数目、胎心跳和胎儿发育状况，从而对胎儿进行全过程的监测和跟踪［10］。同时，联合猪早孕妊娠检测试剂盒又能够及时排除干扰，提高克隆猪妊娠诊断的准确率。

［1］邓立新，王国谨，程福成.B超在母猪妊娠和排卵监测中的应用［J］.猪业科学，2008，25（7）：48.

［2］王少华，杨文科，叶 锋，等.兽用B超在克隆猪研究中妊娠诊断的应用［J］.中国畜牧兽医，2007.34（1）：152－154.

［3］Knox R.Pork Industry Handbook（volume 2）［M］.West Lafayette：Purdue University Press，2010：24－30.

［4］Buddle J R.Therapy In Theriogenology［M］.2ed.Philadelphia：W.B.Saunders Co.，1986：918－923.

［5］田 超.兽用B超在猪繁育中的应用研究［D］.河南郑州：河南农业大学牧医工程学院，2009.

［6］谢富强.兽医影像学［M］.北京：中国农业大学出版社，2010：287－297.

［7］冯现明.B超在母猪怀孕鉴定中的应用［J］.河南畜牧兽医，2005，26（11）：24.

［8］吴建光，熊道焕.小动物腹部超声显像探查技术［J］.动物医学进展，1999，20（4）：18－21.

［9］常 娟，郑秋红，张延廷，等.规模猪场不同月份母猪产仔数的比较［J］.河南畜牧兽医，2009，30（10）：18－19.

［10］刘贤侠，徐 奇，武 磊，等.应用B超对母猪进行早期妊娠诊断的研究［J］.畜禽业，2009（7）：36－39.