应用 SSCP方法诊断遗传性血小板减少综合征

吴祥红,李金梅,康晓明,孟庆云,王凤芝,杨占双,陈秀华

(佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003)

临床上血小板减少症分类复杂,临床症状不一,其中遗传性血小板减少症常常被误诊为血小板减少性紫癜,如何能够快速确诊一直是临床研究热点。本文采用遗传学分析手段辅助一个遗传性血小板减少伴有巨型血小板综合征的家系确诊,希望能够寻找到适用于遗传性血小板减少综合征检测的基因突变位点,为今后诊断遗传性血小板减少综合征奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 临床检查

患儿男性,2岁,因感冒入院治疗,实验室检查发现血小板数量低,但无鼻衄,无紫癜,无皮下与黏膜出血点 ,询问病史与家族史时发现患儿的母亲与外祖母都有血小板减少的症状,并且患儿母亲曾两次接受激素治疗而疗效不佳。因此怀疑此家系为遗传性血小板减少综合征家系,对家系进行临床体检与实验室检查,包括询问病史,神经性耳聋、白内障、间质性肾炎等临床症状筛查与外周血瑞氏染色、血小板计数等实验室检测。对家庭成员检查结果总结归纳并绘制系谱。

1.2 全血 DN A提取

在获得患者家庭成员知情同意后,对患儿家庭成员采2mL外周血,采用全基因组 DN A提取试剂盒 (碧云天生物公司)提取外周血基因组 DN A,-70℃保存备用。

1.3 SSCP检测

总结文献报道数据[1,2],从 M HY-9基因的40个外显子中选取与神经性耳聋相关的 16外显子,30外显子与37外显子 进 行 PCR扩 增。16外 显 子 5`上 游 引 物:GCCGGCAAGCTGGACCCGCATCTC下游引物5`CTCTGCCGA AACTCCTGGAAGACC(150bp)。30外显子上游引物:5`GTGGCCGACATGAAAAAG3`下游引物:5`CTGGTCAA

ACT TCTTCTCC3`(237bp)。37外显子上游引物:5`ATCG ACCAGATCAACACCGACC3`下游引物5`T TGGTCTCGT T GTCCAGC TGC3`(277bp)。 PCR 程 序 为:94°5min,94°30sec,56°30sec72°40sec,30循环。PCR结果经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后,固定,银染 ,封胶,分析结果。

2 结果

总结归纳家系成员临床体征与实验室检查结果(见表1),血小板的正常值在 200～ 300,患儿与患儿母亲的血小板计数明显低于正常值,外周血涂片瑞氏染色后可见巨型血小板。同时家族史调查发现患儿母亲伴有反复中耳炎导致的神经性耳聋的并发症,综合绘制系谱图,系谱分析可见每代都有患者 ,呈连续传递现象,确定为常染色体显性遗传。通过 G显带进行核型分析(结果未显示),但结果未发现有染色体结构的缺失、易位等异常,分析原因是病患所携带的突变可能是单碱基突变造成而并非是染色体片段的缺失或易位,因此核型分析无法检测到。

表1 遗传性血小板减少症家庭成员临床检测结果

图1 外周血瑞氏染色可见巨型血小板

利用 PCR扩增 16外显子、30外显子与 37外显子,观察SSCP电泳结果发现家系中所有血小板减少症的患者16外显子扩增条带都出现异常。其余外显子未发现异常。

3 讨论

遗传性血小板减少症种类繁多,症状复杂,遗传方式有常染色体显性遗传,常染色体隐性遗传,X连锁隐性遗传等方式[4],其中遗传性血小板减少伴有巨型血小板综合征的有常染色体显性与常染色体隐性两种遗传方式,本文中家系遗传方式明显为常染色体显性遗传。根据临床体检伴有神经性耳聋,分析可能是 MYH-9基因突变所导致的血小板减少综合征,核型分析未发现异常,家系成员 MYH9基因 PCR扩增后 DNA片段长度比较也未见差异,最后经测序发现M YH-9基因16外显子突变,可以确诊为 M YH9基因突变所导致的遗传性血小板减少症。

M YH-9基因所编码的非肌性肌球蛋白 IIA(NMM HC-IIA)属于细胞骨架蛋白,是肌球蛋白超级家族成员 ,由2条重链和2对轻链组成的六聚体,总分子量为453KDa。它包含氨基末端的头部(由外显子 1-18编码),颈部(外显子 19)和羧基末端的尾部(外显子20-40),氨基末端可以分别与肌动蛋白和 ATP结合产生运动[5,6]。作为马达蛋白 (motality),他参与细胞分裂,吞噬作用,细胞运动和形态的维持。M YH-9基因的突变可以导致巨血小板减少症,也会影响到除造血系统以外的其他器官,特别是内耳,晶状体和肾脏的足细胞。M YH-9基因的突变临床症状通常表现为四种重叠综合征:May-hegglin综合征、Epstein综合征、Fechtner综合征和Sebatian综合征。四种疾病有着不同的临床表现,Mayhegglin综合征多伴有白细胞包涵体,Epstein综合征多伴有神经性耳聋与间质肾炎,Fechtner综合征则不仅有白细胞包涵体、神经性耳聋与间质肾炎还伴有早发型白内障,Sebatian综合征伴有神经性耳聋并多在老年发生白内障。本家系先证者测序表明 MYH9基因16外显子突变,家系中患者无间质肾炎表现,未发现白细胞内有包涵体,家族中神经性耳聋与白内障的发病时间较晚,分析确诊为 Sebatian综合征。由此可见 SSCP对突变热点筛查是较为快速的确诊手段,可以在临床检验推广实施。

图2 SSCP DN A电泳图

[1] Karina Althaus,Andreas Greinacher.M YH- 9 Related Platelet Disorders:Strategies for Management and Diagnosis[J].Transfus Med Hemother,2010,37:260-267

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[3] Alessandro Pecci,Paolo Gresele,Catherine Klersy.Eltrombopag for the treatment of the inherited hrombocytopenia deriving from MY H9 mutations[J].Blood,2010,116(6):5832-5837

[4] 张淑芳,郑地平,谢俊,等.MY H9相关综合征家系的临床表型和遗传学分析 [J].中国优生与遗传杂志,2008,16(11):113-115

[5] Althaus K,Greinacher A.M YH9-related platelet disorders[J].Semin Thromb Hemost,2009,35:189-203