哈尔滨周边地区猪源致病性大肠杆菌耐药性分析

苏海峰，蒋 月，徐国锋，王磊杰，张 陆，张秀英

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121000）

大肠杆菌存在于人和动物的肠道内，正常情况下为非致病性共栖菌，特殊条件下（如人体虚弱、免疫力降低或胃肠受损等）具有致病性，会导致大肠杆菌病的发生。猪大肠杆菌病就是由致病性大肠杆菌引起猪的一种急性传染病，根据其病原、临床症状、病理剖检及流行病学特征的不同，可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，给养猪业造成了巨大的经济损失。

抗微生物药物在有效遏制猪类各种大肠杆菌感染的同时，也造成了大肠杆菌的严重耐药状况，耐药菌株增加，耐药机制趋于复杂［1］。耐药基因在菌株之间的传递。菌株耐药谱逐年变宽，甚至某些地区出现耐24种药物的菌株［2］。因而在临床用药中应以细菌耐药性调查作为科学依据，这样不仅能减少了耐药性的扩散，对公共卫生意义也很重大［3］。

本文通过对发病猪群进行采样、分离鉴定、致病性试验等分离出致病性大肠杆菌，并对其进行耐药性试验，对其耐药性及耐药谱进行分析，探讨该地区致病性大肠杆菌耐药性现状，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠杆菌质控菌株ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。大肠杆菌临床分离株：分离自哈尔滨市周边地区规模化猪场患黄白痢仔猪的直肠拭子。

1.2 培养基与试剂 试验用麦康凯琼脂、水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）等各种常规培养基以及葡萄糖等微量生化反应管（生产批号：20110315），均购自杭州天和微生物试剂有限公司。试验用14种药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.3 实验动物 试验用小鼠，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.4 分离纯化 将所采集的直肠拭子加入肉汤培养基，37℃培养12～24h，取少量菌液于麦康凯培养基画板，37℃培养24h，挑取圆润粉红色菌落进行纯培养。

1.5 鉴定

1.5.1 镜检 取少量纯培养细菌菌液进行革兰染色，并于显微镜下观察细菌形态，进行初步判断。

1.5.2 生化鉴定 根据陆承平［7］的方法，使用以下生化反应管，即葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌糖、木糖、麦芽糖、甘露醇、枸橼酸、V-P、M.R.，对分离株进行鉴定。

1.6 致病性试验 分离株摇床培养12h，将培养液以生理盐水稀释至5×108CFU／mL，并以0.01 mL／g体重的接种量接种小鼠腹腔，观察小鼠死亡情况，对分离株致病性进行判定。

1.7 药敏试验 按照世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby-Bauer法进行［6］，每次试验前用标准菌株ATCC25922进行质控，药敏试验结果参照CLSI（2007）［7］判定标准进行。见表1。

表1 药敏试验判定标准

2 结果

2.1 分离纯化及鉴定 细菌在麦康凯培养基上呈粉红色菌落。显微镜下菌体呈两端钝圆，革兰染色阴性。生化试验结果见表2。

对照陆承平著书中［5］判定结果进行判定，符合大肠杆菌的生化特征。

2.2 致病性试验结果 对接种28株大肠杆菌培养物的小鼠进行观察，36h内全部死亡。

2.3 药敏试验结果

2.3.1 28株猪源致病性大肠杆菌14种抗菌药物抑菌圈及耐药率结果 见表3。

2.3.2 耐药率分布 各种药物耐药率分布情况见图1。以链霉素、氟苯尼考和复方新诺明的耐药率最高，均在85%以上。磷霉素和多黏菌素B耐药率最低，均低于4%。

表2 细菌生化鉴定结果

表3 28株猪源致病性大肠杆菌耐药试验

图1 28株细菌对14种抗菌药的耐药率

2.3.3 耐药表型 所分离的28株致病性大肠杆菌中存在25个耐药表型，见表4。

2.3.4 多重耐药性 细菌多重耐药情况见图2。细菌多重耐药数以6耐和7耐最多，8耐次之；最少3耐，最高12耐。

表4 28株致病性大肠杆菌的耐药表型

图2 28株猪源致病性大肠杆菌多重耐药情况

3 分析与讨论

3.1 猪源致病性大肠杆菌的耐药情况分析 本试验分析了从哈尔滨周边地区分离的28株猪源致病性大肠杆菌对14种兽医临床常用的抗菌药物的敏感性。结果显示，猪源大肠杆菌分离菌株耐药水平不断提高，多重耐药现象严重。除对多黏菌素B和磷霉素敏感率较高外，对目前常用和应用时间较长的抗菌药物，如链霉素、复方新诺明、氟苯尼考、庆大霉素、多西环素、氯霉素等产生了非常严重的耐药性；所有菌株均呈多重耐药，其中最少的耐药3种，最多的耐药12种。产生这种多重耐药现象的原因可能是：致病性大肠杆菌在药物的选择性压力下耐药基因发生突变，适用了环境压力而产生耐药性［8］；临床上滥用抗生素，大肠杆菌可通过质粒、转座子、整合子等可移动元件获得耐药性［9］。另外，细菌对多黏菌素B耐药率较低，敏感率较高，可为临床用药提供一定的指导作用。

在28株大肠杆菌中出现25个耐药表型，多重耐药现象严重，耐药表型复杂，这可能和不同养殖场的用药史及用药习惯有关，提示临床用药应根据药敏试验结果选择治疗用抗菌药物。

3.2 耐药性现状 本试验结果与宋立等对不同年代食品动物大肠杆菌耐药性调查研究所显示的趋势大致相同，细菌多重耐药数大幅度增加［10］。但青霉素、氯霉素等药物耐药率增长略有不同，这可能和不同地区，用药种类不同所致［11］。本试验大肠杆菌耐药情况结果与丁良君等报道相比，阿莫西林、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星耐药率均降低28.57%～50.71%，其中环丙沙星降低最多（50.71%），磺胺甲噁唑、链霉素耐药率基本不变，多西环素、多黏菌素B耐药率分别增加15%、14.29%［12］。这可能和猪场改变常用药物有关。值得一提的是，氯霉素在禁用之后，耐药率由原来的100%降低到71.43%。提示在停止使用抗生素一定时间后，细菌可能逐渐恢复对其敏感性。由此可见，规范使用抗生素对于减缓细菌耐药性的扩散和传播具有重要的实际意义。

［1］马红霞，刘玉堂，伞治豪.不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析［J］.中国兽医科学，2007，37（12）：1035-1040.

［2］陈雅莉.四川省食品动物源性大肠杆菌耐药性监测及整合子—基因盒检测［D］.雅安：四川农业大学，2010.

［3］赖婧，刘洋，汪宇，等.800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测［J］.中国兽医杂志，2011，47（4）：12-14.

［4］夏伦斌，左瑞华，余道伦，等.规模化猪场致病性大肠杆菌的耐药性分析［J］.中国畜牧兽医，2010，37（6）：183-185.

［5］陆承平.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2007：215-223.

［6］Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

［7］CLSI M31-A3，Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals［S］.

［8］Hongxia Jiang，Zhangliu Chen，Xiumei Wang，et al.High prevalence and widespread distribution of multi-resistant Escherichia coli isolates in pigs and poultry in China［J］.The Veterinary Journal，2011，187：99-103.

［9］Liming Lu，Lei Dai，Yang Wang，et al.Characterization of antimicrobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China［J］.Acta Tropica，2010，113：20-25.

［10］宋立，宁宜宝，沈建忠，等.中国不同年代食品动物大肠杆菌耐药性调查研究［J］.中国科学，2009，39（7）：692-698.

［11］De Jong A，Bywater R，Butty P，et al.A pan-European survey of antimicrobial susceptibility towards human-use antimicrobial drμgs among zoonotic and commensal enteric bacteria isolated from healthy food-producing animals［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2009，63（4）：733-744.

［12］丁良君，张秀英，付锐，等.大肠埃希菌Ⅰ类整合子与多重耐药的相关个性分析［J］.东北农业大学学报，2007，38（6）：771-774.