C-jun在慢性支气管炎大鼠肺中的表达及与气道重塑间的关系初探

何兰芳 李元广 丘韶校

慢性支气管炎是严重危害人民身体健康的常见病和多发病，吸烟是最为重要的诱发因素，气道炎症持续进展并逐渐出现气道结构破坏、气道重塑，进而出现不可逆性通气功能障碍，最终导致呼吸衰竭。慢性支气管炎中气道结构重塑原因目前尚不十分清楚。近年来许多研究发现原癌基因蛋白产物不但参与细胞的生长、分化等过程的调节，且亦能通过多种途径参与慢性炎症的病理变化，其中c-jun作为即刻早期原癌基因在调节细胞增殖及多种蛋白合成中的作用中受到关注。本研究观察吸烟诱导的慢性支气管炎大鼠肺组织中c-jun的表达与小气道重塑之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 C-Jun兔多克隆抗体、鼠抗兔二抗为Santa Cruz产品;SABC免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。Masson胶原染色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。HPLAS-1000高清晰度彩色病理报告分析仪及计算机图象处理系统及相应软件(德国Opten)。

1.2 动物模型的建立、分组及标本处理 实验动物为清洁级SD大鼠，2个月龄雄性大鼠40只，体重(200±20)g，购自中山大学中山医学院实验动物中心。大鼠随机分为正常对照组、吸烟30 d组(Ⅰ组)、吸烟 60 d组(Ⅱ组)、吸烟 90 d组(Ⅲ组)，每组均为10只。参照许三林等的方法制作被动吸烟装置［1］。实验香烟为武汉市售红双喜牌香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量为每支1 mg，焦油含量每支18 mg。吸烟组放人自制的吸烟箱中，每次点燃2支香烟放入，燃烧10 min，休息5 min后再放入2支香烟，每天吸烟40支，每周吸烟6 d。分别在吸烟30、60、90 d后处死各组大鼠。分离肺组织，左下叶置于4%甲醛固定液中保存，常规石蜡包埋、切片4 μm，组织学检查(HE与Masson染色)及免疫组化备用。

1.3 指标观察

1.3.1 肺细小支气管病理及形态学测定 石蜡切片做Masson染色，测定直径在750～1100微米 之间，长径与短径之比不小于0.7的膜性细支气管的外径、管壁厚度(中膜肌层)、管壁面积和气管总面积，然后计算管壁厚度与气管外径比值(MT%)，管壁面积与气管总面积比值(MA%)，并计算出均数，作为大鼠的肺细小支气管气道重构定量指标观察。

1.3.2 C-jun基因表达蛋白JUN免疫组化染色 采用链霉亲和素-过氧化氢物酶法(SABC法)，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液和正常羊血清取代一抗作为空白对照与替代对照。光镜下每张切片随机选5个含有完整支气管横断面的区域，计算阳性细胞个数并作分析。

2 结果

2.1 HE染色观察 HE染色镜下观察:对照组气管、肺泡组织结构正常;Ⅰ、Ⅱ组大鼠肺组织中可见明显慢性细支气管炎，炎症侵犯细支气管全层，炎症细胞侵及全层(包括固有膜、中膜肌层和外膜)，炎症细胞包括单核巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等多种细胞，以单核巨噬细胞、淋巴细胞为主，黏膜下腺体增生明显(图2);而Ⅲ组大鼠与Ⅰ、Ⅱ组比较，除细支气管全层炎症变化外，可见到小气道全层炎症向周围肺组织扩散，细支气管中膜肌层平滑肌显著增生、肥厚，排列紊乱，并有广泛的肺气肿形成。

2.2 各组大鼠细支气管平滑肌层及胶原厚度的比较 Masson染色:对照组及Ⅰ组大鼠细支气管平滑肌层菲薄，Ⅱ、Ⅲ组细支气管中膜肌较正常组显著增生肥厚(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠肺组织JUN表达的比较 正常对照组大鼠肺内几乎无JUN蛋白阳性染色，Ⅰ组大鼠气道JUN蛋白表达较对照组明显增加(P＜0.05)，胞核棕黄色阳性细胞主要于气道上皮细胞、炎性细胞和平滑肌细胞，Ⅱ、Ⅲ组大鼠JUN蛋白阳性细胞多分布于气道平滑肌层及炎性细胞中(P＜0.05)。

3 讨论

慢性支气管炎小气道慢性炎症持续存在，迁延进展，气道炎症导致的组织损伤修复反应可出现气道重构，平滑肌细胞增生及结缔组织沉着，从而使末梢气道腔内呈物理性狭窄，导致肺功能进行性减退。c-jun是禽肉瘤逆转录病毒基因ASV17的细胞内同源基因，由 Bohmann于1987年发现［2］。C-jun原癌基因产物Jun为39 kD蛋白，与原癌基因c-fos产物Fos结合形成异二聚体AP-1或多聚体型反式因子，经由亮氨酸拉链与DNA上相应基因增强子结合起正调控作用。细胞内c-jun借助于其碱性亮氨酸拉链和Jun家族的其他成员或Fos家族成员形成同源或异源二聚体，组成 AP-1转录因子，结合DNA的TPA元件调控区，在转录水平调节下游靶基因的表达，进而调控细胞蛋白质的合成，影响着细胞的增殖与分化等多种病理变化。

本实验观察到在Ⅰ组大鼠在被动吸烟1个月后，中小支气管出现慢性气道炎症，随着吸烟时间的延长，气道炎症逐渐加重;JUN蛋白阳性染色细胞亦出现由少致多的变化，JUN蛋白阳性染色细胞多分布于气道上皮细胞、支气管平滑肌及全气道壁的慢性炎症细胞中，并呈逐渐增多趋势。香烟烟雾产生的氧化应激，能激活气道上皮细胞中的MAPK信号通路，进而增强c-jun活性，激活AP-1相关靶基因，产生增殖、分化、炎症等病理变化［3，4］。Rahman等学者发现香烟烟雾引起的氧化自由基可激活脂氧化物酶途径并调节DNA组蛋白结构，可进一步激活AP-1及NF-κb等转录因子，活化一系列致炎性因子如TNF-α等的表达，促进炎症的发生发展［5］。另有学者发现在吸烟者及实验动物气道上皮在香烟烟雾诱导的氧化应激反应，还可引起NF-κB及AP-1与DNA结合的明显增加，明显增加巨噬细胞炎性蛋白等炎症因子的表达［6］。提示在香烟诱导的慢性支气管炎中，氧化应激对气道造成的损伤可能通过不同途径诱导c-jun等转录因子表达后，通过调节一系列相关基因的表达将炎症反应放大，而随着香烟暴露时间的延长，C-jun表达明显增高，炎症反应亦逐渐加重。

本实验中Ⅰ组大鼠吸烟经过香烟烟雾暴露1个月后，JUN蛋白较表达较对空白照组明显增高，但支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度与空白组无明显变化;Ⅱ、Ⅲ组大鼠JUN蛋白表达较Ⅰ组显著增高，伴随支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度较Ⅰ组明显增加，由此推测原癌基因c-jun的表达可能在气道平滑肌增生、基底膜增厚等间质组织沉积等病理变化中起促进的作用。众多研究表明多种细胞外刺激如炎症、应激等均可激活c-Jun/应激激活性蛋白激酶(JNK)信号通路，使JUN等核转录因子磷酸化，进一步转核调节基因表达，发挥生物学作用［6，7］。而c-jun基因自身的表达亦在AP-1的结合调节的靶基因系列中，由此可推测各种刺激信号在激活JUK信号系统活性时，可通过c-jun/AP-1迅速调整各种蛋白表达，而其中就包括c-jun以及其他细胞因子、生长因子等，进而刺激平滑肌细胞的增生。Wen Ning等学者通过基因表达序列分析及微点阵分析等方法观察处于GOLD 0期(COPD高危期)与GOLD 2期(COPD中期)吸烟者肺组织中基因表达的变化，发现GOLD 2期患者肺组织中JUK的表达明显增高，同时伴随有结缔组织生长因子、转化生长因子等生长因子表达与细胞外基质蛋白的合成的增加，而GOLD 0期吸烟者小气道未有此种气道结构变化，亦无JNK的表达升高［8］，与本试验观察到的实验结果相一致，即在慢支早期无平滑肌细胞增殖及气道结构变化，均提示JUK信号途径及c-jun均可能在慢支的气道结构重塑病理过程中发挥着重要作用，综上，c-jun作为即刻早反应细胞原癌基因可能参与了慢性支气管炎慢性炎症及气道重塑等病理变化。

［1］ 许三林，吴人亮，陈春莲，等.上皮钙粘素在吸烟小鼠呼吸道上皮损伤修复中表达的研究.中华结核和呼吸杂志，1999，22(7):417-419.

［2］ Bohmann D，Bos TJ，Admon A，et al.Human proto-oncogene cjun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1.Science，1987，238(4832)386-392.

［3］ Brooke T.Mossman，Karen M.Lounsbury，Sekhar P.Reddy.Oxidants and Signaling by Mitogen-Activated Protein Kinases in Lung Epithelium.Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34:666-669.

［4］ John A Marwick，Paul A Kirkham，Christopher S Stevenson，et al.Cigarette Smoke Alters Chromatin Remodeling and Induces Proinflammatory Genes in Rat Lungs.Am J Respir Cell Mol Biol，2004，31:633-642.

［5］ I.Rahman，I.M.Adcock.Oxidative stress and redox regulation of lung inflammation in COPD.2006，Eur Respir J，28:219-242.

［6］ Rahman I，P S Gilmour，L A Jimenez，et al.Oxidative stress and TNF-α induce histone acetylation and NF-κB/AP-1 activation in alveolar epithelial cells:potential mechanism in gene transcription in lung inflammation. Mol. Cell. Biochem，2002，234/235:239-248.

［7］ Di Stefano，A，G.Caramori，T.Oats，et al.Increased expression of nuclear factor-kappaB in bronchial biopsies from smokers and patients with COPD.Eur Respir J，2002，20:556-563.

［8］ Wen Ning，Janet Lee，Naftali Kaminski，et al.Comprehensive A-nalysis of Gene Expression on GOLD-2 Versus GOLD-0 Smokers Reveals Novel Genes Important in the Pathogenesis of COPD.Proc Am Thorac Soc，2006，3:466.