核因子κB受体活化因子配体联合巨噬细胞集落刺激因子诱导破骨细胞分化过程中的蛋白—蛋白相互作用网络的研究

周平秀 胡济安 孟祥勇

（1.浙江大学医学院附属口腔医院 口腔病理科，杭州 310006；2.湖州师范学院医学院 口腔系，湖州 313000）

正畸牙移动是在矫治力作用下发生的以牙槽骨吸收和增生为主的一系列复杂的生物过程，其中破骨细胞的分化成熟是正畸牙移动过程中牙槽骨吸收的必要条件。破骨细胞分化成熟过程中的分子机制已成为正畸牙移动研究中的一个热点问题[1]。有研究[2]发现：核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）联合巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）能够诱导外周血单核细胞分化为成熟的破骨细胞。另有研究[3-4]发现：在这一过程中RANKL和MCSF诱导了核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、髓细胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）等多个生物信号分子，激活了肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Wnt等多条信号通路。本研究尝试利用基因芯片数据构建RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞分化成熟过程中的蛋白—蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并通过网络参数分析找出在诱导过程中可能发挥重要作用的基因和基因间关系。

1 材料和方法

1.1 基因芯片数据分析

RANKL联合M-CSF共同诱导小鼠单核细胞系RAW264.7（诱导72 h）的原始的公共基因芯片数据GES16749由NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）数据库提供，相关实验结果由Mann等[5]于2010年发表。利用dCHIP软件对原始基因芯片数据进行归一化，随后比较联合刺激和对照组间的基因表达值，得到表达显著变化的基因，即和对照组相比差异大于等于10倍的基因。

1.2 PPI网络的构建

从小鼠PPI数据库NIA中下载小鼠物种中所有可能的PPI关系[6]。利用小鼠的PPI关系分析表达显著变化基因的邻接基因。利用显著变化基因的邻接基因间的相互作用关系构建RANKL联合M-CSF诱导下的PPI网络。利用统计分析软件R中的图像分析软件包iGRAPH得到PPI网络的基本参数。

1.3 PPI网络中基因的度分布

网络研究中度的定义为网络中一个节点的临边数（等价于这个节点的直接邻接节点数目）。据此笔者利用统计分析软件R分析了RANKL联合M-CSF诱导下PPI网络中每个基因的度。

1.4 PPI网络中基因的介数分析

网络研究的介数的定义为：网络中一个节点的介数等于网络中所有节点对之间通过该节点的最短路径条数。据此笔者用统计分析软件R分析了RANKL联合M-CSF诱导下PPI网络中每个基因的介数。

1.5 PPI网络中的关键分子

根据PPI网络中每个基因的度数和介数作图，利用函数（fx）=衡量基因在网络中的重要性。上式中d表示基因在PPI网络的度数，b表示基因在PPI网络的介数。

1.6 关键基因间的相互作用关系分析

利用生物分子网络分析软件CytoScape v2.8.1中的网络节点件最短路径分析插件，得到关键节点在RANKL联合M-CSF诱导下PPI网络中的相互作用关系。

2 结果

2.1 RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞发育过程中的PPI网络

对芯片数据GES16749分析后发现：以对照组为参照，在RANKL联合M-CSF诱导组中出现了97个10倍及以上差异表达的基因。利用小鼠PPI数据库NIA，得到由这些显著差异基因及其邻接基因构成的PPI网络，见图1。

图 1 RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞分化发育过程中的PPI网络Fig 1 PPI network of RANKL and M-CSF induced osteoclasts maturing

利用统计分析软件R中的iGRAPH分析可以得出，整个网络中有743个基因节点和821条边（基因间相互作用关系），见表1。

表 1 RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞发育过程中PPI网络的基本参数Tab 1 Main parameters of PPI network in RANKL and M-CSF induced osteoclasts maturing

2.2 PPI网络中基因的度分布

通过对PPI网络中基因度分布的分析发现：转化生长因子β受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）、劳氏肉瘤原癌基因（Rous sarcoma oncogene，SRC）、MYC、整合素β3（integrin beta 3，ITGB3）、整合素α5（integrin alpha 5，ITGAⅤ）、鸟嘌呤脱氨酶（guanine deaminase，GDA）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、小鼠γ丝蛋白C（filamin C gamma，FLNC）、巨噬细胞刺激蛋白受体（macrophage stimulating 1 receptor，MST1R）和基质金属蛋白酶-14（matrix metalloproteinases-14，MMP-14）具有较多的邻接基因（图2）。这提示在RANKL联合M-CSF诱导过程中，上述基因具有能够和多种蛋白质分子发生相互作用的能力，它们可能是对分化过程具有重要影响的关键基因。

图 2 PPI网络中的度分布Fig 2 Node degree distribution of PPI network

2.3 PPI网络中基因的介数

为进一步分析PPI网络中的关键基因，本研究分析了网络中每一个基因节点的介数，介数表示了该基因节点能够出现在网络中每两个基因节点最短路径上的次数。在PPI网络中，基因节点的介数很好地描述了每个基因节点可能需要承载的信号传导流量。在分析结果时，笔者发现SRC、TGFBR1、MYC、ITGB3等是PPI网络中重要的信号承载分子（图3）。

图 3 PPI网络中的关键分子Fig 3 Key molecular of PPI network

2.4 PPI网络中的关键分子

为找出诱导过程中的关键分子，本研究综合分析了PPI网络中每个基因的度数和介数，结果发现TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3基因具有较高的度数和介数（图3）。这提示在RANKL联合M-CSF诱导过程中，这4个分子能够和多种蛋白质分子相互作用，同时也承载着重要的信号传导功能，它们很可能是RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞发育过程中的关键分子。

2.5 网络中的关键分子间的相互作用关系

为进一步分析关键分子TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3间的相互作用关系，本研究在PPI网络中寻找这4个关键分子间的最短相互作用路径，结果发现：这4个关键分子能通过2个基因表达量下调的分子肾上腺素受体β2（adrenergic receptor beta 2，ADRB2）与DAB2（disabled homolog 2 Drosophila），以及3个基因表达水平无明显变化的分子BCR（breakpoint cluster region）、CSNK2A2（casein kinase 2 alpha prime polypeptide similar to casein kinaseⅡalpha prime subunit）和RAF1（Ⅴ-raf-leukemia viral oncogene 1）发生相互作用（图4）。相关基因的差异表达值和网络属性见表2。

图 4 关键分子在PPI网络上的相互作用关系预测Fig 4 Prediction of interactions between key genes in PPI network

表 2 关键基因及其相互作用基因列表Tab 2 List of key genes and their neighbor genes

3 讨论

随着生物信息学和系统生物学研究的不断发展，不同类型的生物分子相互作用网络，例如基因转录调控网络、代谢网络和PPI网络已经在认识特定生物学过程中发挥了重要作用。而随着口腔正畸学基础研究的不断深入，高通量实验数据日益丰富，特定生物学问题也不断涌现，为系统地认识口腔正畸过程带来了新的机遇与挑战[5]。

本研究尝试利用基因芯片数据和蛋白质相互作用数据库，进一步认识正畸牙移动中的一个重要生物过程——RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞分化成熟过程，并构建了针对这一特定分化发育过程中可能存在的PPI网络。通过网络拓扑结构分析，笔者推测RANKL联合M-CSF诱导破骨细胞分化过程的关键分子可能是TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3，其周边基因可能是ADRB2、BCR、RAF1、CSNK2A2和DAB2。在这些分子中TGFBR1是转化生长因子信号通路中上游的细胞膜受体，是细胞接收细胞外信号转化生长因子β的主要受体之一[7]。TGFBR1在RANKL联合MCSF刺激后的基因表达上调的结果提示：细胞在接受早期外界信号刺激后，能够在细胞膜表面产生新的膜受体以接受外界不断变化的信号分子，从而保障分化过程中细胞与外界信号的交流。这一结果提示转化生长因子β信号通路在RANKL联合M-CSF诱导分化过程中发挥着重要作用。在对其他关键分子的研究[8]中发现：MYC是RANKL下游不可或缺的分子，在破骨细胞发育过程中发挥着调控细胞增殖的关键作用。BCR、RAF1参与激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，能够促进造血细胞早期发育过程[9]。根据图4结果可以看出，在RANKL联合M-CSF诱导过程中，诱导细胞增殖的信号很可能从BCR的磷酸化开始（BCR在诱导过程中的基因表达水平无明显变化），改变RAF1的磷酸化水平，并进一步激活MYC发挥调控单核细胞增殖的作用。而在诱导过程中差异表达显著的SRC也能激活MYC调控细胞的增殖[10]。同时SRC作为ErbB信号通路中的重要分子还能够激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）发挥调控细胞黏附分子的作用[11]。这些结果说明：细胞黏附分子的改变作为破骨细胞分化的重要步骤，在伴随着细胞增殖的过程中也逐步发生了。

生物信息学分析为认识特定的生物学问题提供了新方法，然而对生物学问题的深入认识仍然需要在分子生物学水平进行研究。后续研究将结合本研究结果，展开分子生物学实验，探讨RANKL联合MCSF诱导破骨细胞分化过程中分子间的相互作用。

[1] Wise GE,King GJ.Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement[J].J Dent Res,2008,87（5）：414-434.

[2] Zauli G,Rimondi E,Nicolin V,et al.TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL） blocks osteoclastic differentiation induced by RANKL plus M-CSF[J].Blood,2004,104（7）：2044-2050.

[3] Shiotani A,Takami M,Itoh K,et al.Regulation of osteoclast differentiation and function by receptor activator of NFκB ligand and osteoprotegerin[J].Anat Rec,2002,268（2）：137-146.

[4] Takahashi N,Maeda K,Ishihara A,et al.Regulatory mechanism of osteoclastogenesis by RANKL and Wnt signals[J].Front Biosci,2011,16：21-30.

[5] Mann M,Barad O,Agami R,et al.miRNA-based mechanism for the commitment of multipotent progenitors to a single cellular fate[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107（36）：15804-15809.

[6] Yellaboina S,Dudekula DB,Ko MSh.Prediction of evolutionarily conserved interologs in Mus musculus[J].BMC Genomics,2008,9：465.

[7] Johnson DW,Qumsiyeh M,Benkhalifa M,et al.Assignment of human transforming growth factor-beta typeⅠand typeⅢreceptor genes（TGFBR1 and TGFBR3） to 9q33-q34 and 1p32-p33,respectively[J].Genomics,1995,28（2）：356-357.

[8] Battaglino R,Kim D,Fu J,et al.C-myc is required for osteoclast differentiation[J].J Bone Miner Res,2002,17（5）：763-773.

[9] Skorski T,Nieborowska-Skorska M,Szczylik C,et al.C-RAF-1 serine/threonine kinase is required in BCR/ABL-dependent and normal hematopoiesis[J].Cancer Res,1995,55（11）：2275-2278.

[10] Costa-Rodrigues J,Teixeira CA,Sampaio P,et al.Characterisation of the osteoclastogenic potential of human osteoblastic and fibroblastic conditioned media[J].J Cell Biochem,2010,109（1）：205-216.

[11] Faccio R,Novack DV,Zallone A,et al.Dynamic changes in the osteoclast cytoskeleton in response to growth factors and cell attachment are controlled by beta3 integrin[J].J Cell Biol,2003,162（3）：499-509.