GC-MS/MS法测定人头发中的大麻酚类及其代谢物

赵 晖，卓先义，向 平，严 慧，沈保华

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；2.复旦大学附属华山医院，上海200032）

GC-MS/MS法测定人头发中的大麻酚类及其代谢物

赵 晖1，2，卓先义1，向 平1，严 慧1，沈保华1

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；2.复旦大学附属华山医院，上海200032）

目的 建立同时检测头发中 Δ9-四氢大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 Δ9-四氢大麻酸（THCCOOH）的分析方法。方法 头发样品加入氘代内标Δ9-四氢大麻酸（THC-COOH-d3），经碱水解后，以混合溶剂[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯=9∶1]进行提取，吹干，残留物经双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS方法进行分析。 结果 头发中THC-COOH、THC、CBN和CBD的最低检出限分别为4、4、10和20 pg·mg-1， 各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好的线性关系（r＞0.999），方法精密度、准确度均符合要求。结论 本方法选择性强、灵敏度高，适用于头发中CBD、CBN、THC及其代谢物THC-COOH的分析，并成功应用于实际案例中。

大麻酚；四氢大麻酸；头发分析；GC-MS/MS

Abstract：ObjectiveTo develop a gas chromatography-tandem mass spectrometry （GC-MS/MS） method for the simultaneous analysis of Δ9-tetrahydrocannabinol （THC），cannabidol （CBD），cannabinol （CBN） and 11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol （THC-COOH）in human hair.MethodsHair sample was spiked with deuterium labeled 11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol （THC-COOH-d3） as internal standard，prior to being hydrolyzed with sodium hydroxide.The mixture was extracted with n-hexane/ethyl acetate （9： 1），derived with N，O-bis-（trimethylsilyl）-trifluoroacetamide （BSTFA），and analyzed with GC-MS/MS.ResultsThe limit of detection of THC-COOH，THC，CBN and CBD were 4，4，10，and 20pg/mg，respectively.Calibration curves covered a range from 0.04 to 5 ng/mg with good linearity （r＞0.999）.The accuracy and precision of analytes all met the requirements.ConclusionThe method has a good selectivity and high sensitivity，and is applicable to the analysis of CBD，CBN，THC and their metabolite THC-COOH.It has been verified in real cases.

Key words：cannabis;cannabinoid;THC-COOH;hair analysis;GC-MS/MS

大麻是一类化学成分复杂的精神活性药物，Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）是其主要成分。其中THC是大麻的主要活性成分，即使人体内血药浓度低于1ng·mL-1，也会产生持续作用[1]，令使用者产生欣快感、幻觉，引起血压变化和心动过速。 Δ9-四氢大麻酸 （11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol，THC-COOH）是THC的主要代谢物。

人体摄取大麻后，大麻酚类与大麻酸将沉积在毛发中，Skopp等[2]证明了毛发中大麻类成分沉积量与大麻摄入量的相关性，通过毛发分析可以定性/定量确认检查对象长周期内的大麻使用情况。毛发分析协会（societyofhairtesting，SOHT）推荐毛发中THC及THCCOOH 检测的cut-off值分别为0.05及0.005ng·mg-1[3]。在无法排除大麻酚类来自外部污染的情况下，阳性结果需要检测THC-COOH进行确认[4]。大麻酚类（ng·mg-1级）和大麻酸（pg·mg-1级）成分在毛发中的含量极低[5-6]，并且毛发中内源性杂质较多，背景干扰严重，因此对毛发去污处理、分析仪器的灵敏度、特异性要求较高。向平等[7]报道了头发中大麻酚类和Δ9-四氢大麻酸GC/MS分析方法，但对于THC-COOH检出限（LOD）为0.01ng·mg-1，不能满足 0.005ng·mg-1cut-off值的要求。本研究利用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）、多反应监测模式（multiple reactions monitor，MRM），同时检测头发中的大麻成分THC、CBD、CBN以及THC主要代谢物THC-COOH。本方法前处理简单，分析速度快，能满足实际工作的需要。

1 材料和方法

1.1 试剂与材料

THC、CBN、CBD对照品（国家麻醉品实验室）；Δ9-THC-COOH对照品（美国 Cerilliant公司）；内标Δ9-THC-COOH-d3对照品（美国 Sigma公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国 Sigma公司）；BSTFA（美国Cerilliant公司）；去离子水由 Milli-Q（美国Millipore公司）制备；其它试剂均为分析纯。空白头发来自健康志愿者；实际头发样品来自疑有大麻滥用史的嫌疑人头发。

1.2 储备溶液与工作溶液的制备

分别取 0.1mg·mL-1的 THC 对照品溶液、0.1mg·mL-1的CBD对照品溶液、0.1mg·mL-1的CBN对照品溶液和 0.1mg·mL-1的THC-COOH 对照品溶液各 100μL，用甲醇配制成10μg·mL-1的混合储备溶液。依次用甲醇以 10 倍梯度稀释储备液，得到 1μg·mL-1、100ng·mL-1、10ng·mL-1的混合工作溶液。 另取 0.1mg·mL-1的THC-COOH-d3对照品溶液，用甲醇配制成1μg·mL-1的内标工作溶液。

1.3 仪器

Waters Quatto Micro气相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司），配有电子轰击源以及MassLynx数据处理系统。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件

HP-1MS石英毛细管柱 （30m×0.25mm×0.1μm）；分流比 2∶1；载气：氦气；程序升温：100℃保持 1.5min，以升温速率25℃/min升温至280℃保持5min；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；进样量：1μL。

1.4.2 质谱条件

质谱检测采用MRM模式，以一级质谱分析结果为基础，选择各目标物的分子离子，优化碰撞能量（CE），得到各目标物和内标的二级质谱图。CBD、CBN、THC、THC-COOH和 THC-COOH-d3的 MS/MS条件见表1。

表1 大麻酚类及THC-COOH和内标的MS/MS条件

1.5 头发样品预处理

头发样品依次用0.1%十二烷基磺酸钠 （SDS）溶液、0.1%洗洁精溶液、去离子水、丙酮振荡洗涤。将头发转移至布氏漏斗中，滤去洗液后晾干，剪至成长约1～2mm。

称取剪至约1～2mm的头发50mg置试管中，加入0.5mL 1mol·L的NaOH溶液，加入 10μL内标工作液，在80℃水浴中水解20min。冷却后，加入 20μL冰醋酸，调节体系pH至7～8，加入混合溶剂[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1]3mL，混旋，867×g 离心 3min，转移有机相。向水相中加入20μL冰醋酸，调节体系pH至4～5，再用以上混合溶剂提取一遍。合并两次提取液，置于60℃水浴中空气流下吹干，残留物中迅速加入20μL 乙腈和 20μL BSTFA，混旋，密封，置于烘箱中70℃衍生化20min。取1μL进样于GC-MS/MS。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS/MS分析条件的优化

分别取 1μg·mL-1THC、CBN、CBD、THC-COOH和THC-COOH-d3对照品，BSTFA衍生化后，取1μL进入GC-MS/MS。本方法中质谱检测采用MRM模式：（1）电离目标化合物，产生碎片离子，选取特征离子，作为母离子；（2）调节碰撞能量（CE），裂解母离子，得到各化合物的二级质谱离子；（3）选取响应高的特征性二级碎片离子，作为子离子，组成母离子/子离子对，每目标物选用两对母离子/子离子对用于定性分析，其中一对母离子/子离子对用于定量分析。

2.2 方法专属性

由于目标化合物在毛发中的含量低，同时毛发中有较多的内源性杂质，背景干扰严重，这就要求检测体系需同时具有高灵敏度和高特异性。本研究考察了对头发中目标化合物的专属性：空白头发样品、添加内标的头发样品以及添加了10ng混合对照品的头发样品按1.5项下方法处理后，依次取1μL进样，GC-MS/MS进行分析，结果表明，空白头发的内源性基质在目标化合物和内标对应信号处无干扰（图 1）。

图 1 空白毛发添加内标（A）及添加了10ng混合对照品（B）的色谱图

2.3 线性范围和最低检测限

空白头发50mg若干份，分别加入内标物工作液，再加入不同浓度的目标物 （THC、CBN、CBD、THCCOOH）混合工作溶液，配制成质量分数分别为0.004、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2 和 5ng·mg-1的系列质量分数样品，按1.5项下方法进行样品前处理，按1.4项下GC-MS/MS条件进样分析。以目标化合物峰面积和内标峰面积的比值与目标物相应质量分数进行线性回归，求得各目标物的线性回归方程（见表2）。结果表明各目标物线性关系良好，相关系数r均大于0.999。

THC-COOH的LOD可低至0.004ng·mg-1，定量下限（LOQ）为 0.04ng·mg-1，能满足 SOHT 推荐的毛发中THC及THC-COOH检测的cut-off值[3]0.05及0.005ng·mg-1的要求。

2.4 准确度、精密度和回收率

空白头发50mg若干份，同2.3项下方法配制得目标物质量分数分别为0.04，0.4，5ng·mg-1的头发样品各6份，按以1.5项下方法进行样品前处理，按1.4项下GC-MS/MS条件进样分析。通过计算每个样品的实际测定值与配制值的百分比，考察方法的准确度；通过计算每个质量分数点样品的相对标准偏差，考察方法的精密度。结果见表3，本方法的准确度为82.0%～116.3%，方法的精密度RSD＜20%。

表3 毛发中THC、CBN、CBD、THC-COOH的准确度和精密度

表2 毛发中THC、CBN、CBD、THC-COOH的线性方程、相关系数、LOD和LOQ

3 方法应用

应用本方法，对两名疑有大麻滥用史的嫌疑人的头发进行分析，两名嫌疑人的尿液分析依据LC-MS/MS方法[8]进行，用于判定嫌疑人近期大麻使用情况，通过定性分析，尿液中检出CBN、THC和THC-COOH成分。按照本研究建立的方法，从两名嫌疑人头发中均检出CBN和THC（定量结果见表4）。两名对象头发中THC浓度均高于SOHT推荐的THC cut-off值0.05ng/mg-1，由此可以推断两名嫌疑人存在滥用大麻行为。

表4 实际案例中大麻滥用嫌疑人的头发分析结果

本研究建立的GC-MS/MS分析方法，头发用量少，特异性强，灵敏度高，线性范围宽，可同时分析人毛发中的CBD、CBN、THC和THC-COOH。本方法前处理简单，分析速度快，能满足吸食大麻鉴定实际工作的需要。

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[2]Skopp G，Strohbeck-Kuehner P，Mann K，et al.Deposition of cannabinoids in hair after long-term use of cannabis[J].Forensic Sci Int，2007，(170)：46–50.

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[6]Uhla M，Sachsb H.Cannabinoids in hair： strategy to prove marijuana/hashish consumption[J].Forensic Sci Int，2004，(145)：143-147.

[7]向平，沈敏，沈保华，等.GC/MS同时分析头发中大麻酚类和Δ9-四氢大麻酸[J].法医学杂志，2002，18（4）：216-219.

[8]卓先义，赵晖，向平.液相色谱-串联质谱同时分析尿液中的大麻酚类和 Δ9-四氢大麻酸[J].中国司法鉴定，2008，(1)：21-25.

（本文编辑：刘 伟）

Analysis of Cannabinoids and The Main Metabolite in Human Hair by GC-MS/MS

ZHAO Hui1，2，ZHUO Xian-yi1，XIANG Ping1，YAN Hui1，SHEN Bao-hua1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China；2.Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，China）

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2012.05.008

1671-2072-（2012）05-0071-04

2012-05-16

质检公益性行业科研专项（10-137）；上海市法医学重点实验室资助项目（12DZ2271500）

赵晖（1984—）男，硕士研究生，主要从事毒物化学研究。 E-mail：bcldrhui@126.com。

沈保华（1968—）男，主任法医师，主要从事毒物化学研究。 E-mail： shenbh@ssfjd.cn。