怀牛膝中化学成分的分离与鉴定

杨柳，姜海，杨炳友，王秋红，匡海学

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

怀牛膝为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根，主产于河南。具有补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行之功效，用于腰膝酸痛，筋骨无力，经闭癥瘕，肝阳眩晕［1］。药理研究表明，怀牛膝具有抗生育、镇痛、抗炎、增强免疫功能、抗衰老等作用［2－3］。前期实验研究结果表明，牛膝水煎液的大孔树脂50%乙醇洗脱组分具有抗骨质疏松活性，为了阐明其药效物质基础，对牛膝大孔树脂50%乙醇洗脱组分进行系统的化学成分研究，曾报道从该组分中分别分离得到了新的甾酮类化合物［4］，在前期实验的基础上，利用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、制备型HPLC等色谱手段，进一步从牛膝中分离得到5个单体化合物，其中化合物1为首次从该植物中分离得到。

1 仪器和材料

Bruker－400型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司，1H －NMR:400 MHz，13C －NMR:100 MHz);ACQUITY Ultra Performance LCTM液质联用色谱仪;Delta 600－2487制备型 HPLC(美国Waters公司);制备型色谱柱 Hypersil－ODSⅡ(10μm，20mm ×300mm，大连依利特公司);硅胶(青岛海洋化工厂，80～100，200～300目);薄层色谱用硅胶板(Silica gel60F254)和反相薄层板(Rp－18)(德国 Merck公司);柱色谱用反相ODS－AM(日本YMC公司);D101大孔吸附树脂(南开大学化工厂);色谱层析用化学试剂为分析纯(天津试剂一厂)。

Tab.1 13C －NMR data of compounds 1－2(in C5D5N，100 MHz，δ in ppm)

药材经黑龙江中医药大学药学院中药资源教研室王振月教授鉴定为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根。原植物标本保存于黑龙江中医药大学药学院中药化学教研室。

2 提取分离

将干燥的牛膝3kg，以水煎煮提取3次，每次2h，滤过，合并水提液，减压回收，得水溶液提取物。水溶液提取物经D101型大孔吸附树脂柱色谱，用H2O、50%EtOH和95%EtOH依次洗脱，其中50%EtOH洗脱液经减压回收得50%EtOH洗脱组分(90g)。50%EtOH洗脱组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷－甲醇溶剂梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.1－8)。Fr.2经正相硅胶柱色谱(二氯甲烷－甲醇)及反相ODS(甲醇－水)等方法得到化合物 3(54mg)、4(21mg)、5(27mg)。Fr.5经反相ODS(甲醇－水)及制备型HPLC(甲醇－水)等方法得到化合物1(32mg)、2(30mg)。

3 结构鉴定

化合物1:白色粉末，UV λmax:241.5nm，HR －ESI－MS(m/z):485.288 9［M+Na］+，表明其分子量为462，推测其分子式为 C27H42O6。1H －NMR(C5D5N)谱中，在 δ1.21、1.06、1.56 和 1.66 处出现 4 个甲基信号，在 δ6.25(1H，d，J=2.4Hz)处可见 1 个烯氢质子的信号。13C－NMR(C5D5N)谱中，出现27个碳信号，其中δ203.0为α、β－不饱和羰基上的一个酮羰基信号，δ166.1、122.0为三取代的双键碳信号，通过以上数据初步推测为含27个碳的植物甾酮类化合物，具有甾酮类化合物的特征信号。除此以外，在δ4.74(1H，brs)和4.77(1H，brs)处还分别出现2个烯氢信号。据此推测化合物1中不仅存在α、β不饱和羰基结构外，另外还具有一个末端双键。通过13C－NMR和HSQC谱的综合解析，可知末端双键存在于C25和C26间。将化合物1的1H－NMR、13C－NMR谱数据(见Table.1)与文献报道的25，26－二去氢坡那甾酮A波谱数据［5］相比较，两者基本一致，所以鉴定化合物1为25，26－二去氢坡那甾酮 A(25，26－dehydroponasteroneA)。

化合物2:白色粉末，UV λmax:242.0nm，HR －ESI－MS(m/z):357.168 8［M+Na］+，表明其分子量为334，推测其分子式为 C19H26O5。化合物2的1HNMR和13C－NMR(C5D5N)谱中同样出现了甾酮类化合物的特征信号，结合1H、13C－NMR谱，推测化合物2为含有19个碳的甾酮类化合物，可能其C17位的侧链被氧化消失。δ200以上给出1个孤立的饱和羰基碳信号δ217.2，表明分子中具有五元环酮结构。将化合物2的碳谱数据与化合物1进行比较，发现其C1－C15位的化学位移基本没有变化，而C17位变化很大，推测C17位侧链消失，并羰基化。将化合物 2的1HNMR、13C－NMR谱数据与文献报道的红苋甾酮波谱数据［6］相比较，两者基本一致，所以鉴定化合物2为红苋甾酮(rubrosterone)。

化合物3:黄色粉末，Dragendorff反应产生桔红色沉淀，HR －ESI－ MS(m/z):359.124 1［M+Na］+，表明其分子量为336，推测其分子式为C20H18NO。13CNMR(CD3OD):δ106.6(C － 1)，150.0(C －2)，152.0(C －3)，109.4(C － 4)，28.2(C －5)，57.7(C － 6)，145.8(C －8)，152.2(C －9)，62.5(9 － OCH3)，146.4(C －10)，57.2(10 － OCH3)，121.9(C －11)，124.5(C－12)，128.1(C －13)。将化合物3的1H －NMR、13C－NMR谱数据与文献报道的小檗碱的波谱数据［7］相比较，两者基本一致，所以鉴定化合物3为小檗碱(berberine)。

化合物4:白色粉末，Molish反应呈紫色，HR－ESI－MS(m/z):259.115 0［M+Na］+，表明其分子量为236，推测其分子式为 C10H20O6。13C－NMR(CD3OD):δ60.6(C －1)，32.6(C －2)，19.8(C －3)，14.1(C －4)，64.1(C －1')，101.2(C －2')，70.6(C －3')，72.1(C －4')，71.3(C －5')，65.0(C －6')。将化合物 4的1H－NMR、13C－NMR谱数据与文献报道的正丁基吡喃果糖苷的波谱数据［8］相比较，两者基本一致，所以鉴定化合物4为正丁基吡喃果糖苷(n－butyl－β－D－fructopyranoside)。

化合物5:无色片状结晶，易溶于甲醇，HR－ESI－MS(m/z):277.142 4［M］+，表明其分子量为 278，推测其分子式为 C16H22O4。13C－NMR(CD3OD):δ132.4(C －1，2)，129.9(C －3，6)，133.6(C －4，5)，169.3(C －1')，66.6(C －1″)，31.7(C －2″)，20.3(C －3″)，14.1(C － 4″)。将化合物 5 的1H － NMR、13C －NMR谱数据与文献报道的邻苯二甲酸二丁酯的波谱数据［9］相比较，两者基本一致，所以鉴定化合物5为邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:67.

［2］ 孟大利，李铣.中药牛膝化学成分和药理活性的研究进展［J］.中国药物化学杂志，2001，11(2):120 －124.

［3］ 董琦，郭新民，聂影，等.怀牛膝对2型糖尿病大鼠脑组织p75基因表达的影响［J］.中医药学报，2007，35(6):20 －21.

［4］ Qiuhong Wang，Liu Yang，Hai Jiang，et al.Three new phytoecdysteroids containing a furan ring from the roots of Achyranthes bidentata Bl［J］.Molecules，2011，16(7):5989 －5997.

［5］ Tiejun Ling，Zhengzhu Zhang，Tao Xia，et al.Phytoecdysteroids and other constituents from the roots of Klaseopsis chinensis［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2009，37(1):49－51.

［6］ 孟大利，侯柏玲，汪毅，等.中药牛膝中的植物甾酮类成分［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(9):562 －564.

［7］ 孟大利.中药牛膝化学成分及其生物活性的研究［D］.沈阳:沈阳药科大学，2004:37.

［8］ 汪涛，崔书亚，索有瑞，等.怀牛膝水溶性化学成分研究［J］.中国中药杂志，2004，29(7):649 －651.

［9］ 韦松，梁鸿，赵玉英，等.怀牛膝中化合物的分离鉴定［J］.中国中药杂志，1997，22(5):293 －295.