葡萄籽中多酚类物质提取工艺的研究

周曼，曹唯仪，王玉蓉

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

葡萄籽主要含有多酚类物质(GPS)，包括儿茶素类和原花青素类。其中儿茶素类包括儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯，是葡萄籽中主要的单聚体，也是原花青素寡聚体和多聚体的构成单位，在植物体内经生物化学反应而形成复杂的聚合物［1］，是一种强抗氧化剂，其抗氧化功效是维生素C的20倍、维生素E的50倍;具有抗氧化及清除自由基、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、治疗心血管疾病、提高免疫功能、预防神经退行性改变等作用［2－4］。本文采用正交试验方法，以儿茶素为指标，筛选葡萄籽中多酚类有效部分的提取工艺，考察葡萄籽的最佳提取工艺参数。

1 仪器与试药

RE52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);B－220型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂);紫外可见分光光度计(上海先科分光仪器有限公司);BSIIOS型电子分析天平(北京市赛多利斯仪器系列有限公司);G16型医用高速离心机(安新白洋离心厂)。

儿茶素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110877－201102);葡萄籽(购自河北安国药材市场，经本校陈玉婷教授鉴定为正品);香草醛、甲醇、浓盐酸(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 对照品储备液的制备 取105℃干燥至恒重的儿茶素对照品，精密称定20.18mg，置50mL量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取葡萄籽粗粉1.029 4g，置100mL圆底烧瓶中，加60%乙醇溶液50mL，水浴回流提取2次，每次30min，滤过，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，水相转移至100mL量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，定容［5］。取上述溶液4mL，离心30min(16 000r/min)，取上清液，备用。

2.1.3 吸收波长的选择 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，置10mL比色管中(避光)，加入3.0mL 4%香草醛甲醇溶液和1.5mL浓盐酸，混匀，室温放置显色15min［6］。以纯水为空白，在200～800nm波长范围内进行扫描，结果显示，对照品溶液和供试品溶液均在500nm处有最大吸收峰，确定吸收波长为500nm，见图1。

图1 对照品溶液和供试品溶液吸收波长扫描图

2.1.4 儿茶素标准曲线的制备 分别精密移取对照品储 备 液 1.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、7.0mL、8.0mL，置10mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。分别移取上述不同浓度对照品溶液各0.5mL，置10mL比色管中(避光)，加入3.0mL 4%香草醛甲醇溶液和1.5mL浓盐酸，混匀，室温放置显色15min。以纯水为空白，照紫外－可见分光光度法，在500nm处测定吸光度(A)。以儿茶素浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1.773X+0.000 1，r=0.999 8。结果显示，儿茶素对照品在0.038 1～0.304 8mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 不同提取条件对多酚提取效果的影响

2.2.1 乙醇浓度对多酚提取效果的影响 准确称取葡萄籽粗粉5份，分别置于100mL圆底烧瓶中，依次加入8BV 20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液，回流提取2次，每次30min，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，水相用蒸馏水定容至100mL，摇匀，备用。精密量取2.0mL样品溶液，置10mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得各乙醇浓度项下供试品溶液。取供试品溶液4mL，离心30min(16 000r/min)，吸取上清液0.5mL，置10mL比色管中(避光)，照儿茶素标准曲线制备项下的方法，测定样品溶液的吸光度，计算多酚得率。结果显示，40%、60%乙醇多酚得率较高，见图2。

图2 乙醇浓度对多酚提取效果的影响

2.2.2 溶剂倍量对多酚提取效果的影响 考察6BV、8BV、10BV、12BV及14BV溶剂倍量对多酚提取效果的影响，其余操作同2.2.1。结果显示，10BV乙醇较为适宜，见图3。

图3 溶剂倍量对多酚提取效果的影响

2.2.3 提取时间对多酚提取效果的影响 考察提取时间 30、60、90、120、150min 对多酚提取效果的影响，结果显示，1.5h多酚得率可达90%以上，见图4。

图4 提取时间对多酚提取效果的影响

2.3 正交试验优选 L9(34)正交试验方法考察乙醇浓度(A)、提取次数(B)和提取时间(C)，10BV提取溶剂，以多酚含量为指标，并计算提取物干膏得率。结果见表1～3。

表1 L9(34)因素水平表

表2 正交试验与结果

表3 方差分析表

方差分析结果显示，B因素有显著统计学意义，各因素对得率的影响次序为:B＞C＞A。A1B3C3为最佳提取方案，即10倍量50%乙醇，提取3次，每次2h。但是考虑到提取时间过长对多酚类成分的稳定性会有影响，拟对总提取时间做调整。

2.4 时间对比试验 以多酚类物质得率为指标，测定药材中多酚类成分的含量，验证优化工艺参数的可行性，结果见表4。

表4 时间对比试验 (n=3)

结果显示，提取时间延长，含量无显著性差异。综合考虑工业成本、提取效率，用10倍量50%乙醇，提取3次，第1次2h，第2次1h，第3次1h，药材中多酚含量为2.31%，出膏率为7.11%。

3 讨论

葡萄籽中的含量测定方法主要有香草醛－盐酸比色法和铁盐催化比色法，但铁盐催化比色法对样品中含水量要求苛刻，显色温度较高，时间较长。因此，选择操作简便的香草醛－盐酸比色法。

通过单因素考察，分别比较了乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间对提取多酚类成分工艺的影响，为正交试验提供合理可靠的考察因素和水平。通过正交试验设计优选出A1B3C3，即10倍量50%乙醇，提取3次，每次2h，并对总提取时间做了调整。通过对比试验，得出提取时间延长，对含量无显著性影响。综合考虑工业成本、提取效率，最终确定用10倍量50%乙醇，提取3次，提取4h。

［1］ 刘向荣，邓银华.葡萄籽多酚性成分对小鼠抗氧化作用研究［J］.中国药学杂志，2010，45(11):835 －837.

［2］ 左媛，王晓闻.葡萄籽提取物研究进展综述［J］.山西科技，2010，25(3):138－139.

［3］ 杨立军.葡萄多酚的研究概况［J］.海峡药学，2009，21(6):103－105.

［4］ 高军涛，HuiruTang，侯京武，等.葡萄籽中多酚类物质对氧自由基清除作用的 ESR 研究［J］.波谱学杂志，1999，16(5):409－415.

［5］ 向阳，马龙，苏德奇.比色法测定葡萄皮和葡萄籽中的含量［J］.中国公共卫生，2003，19(10):1228 －1229.

［6］ 王光亚.保健食品功效成分检测方法［M］.北京:中国轻工业出版社，2002:159－160.