通腑汤对急性肺损伤大鼠肺组织NF－κB p65的影响

李竹英，王雪慧，刘建秋

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

急性肺损伤(ALI)以细胞因子大量释放为特征的全身过度炎症反应为发病基础，发病机制复杂，其中，促炎因子及炎症介质引发的级联效应为近年来研究的热点之一［1］。核转录因子κB作为炎性因子级联效应的中心因子，在ALI疾病过程中受LPS刺激下被激活，为ALI发病过程中的特异性因子，本研究将系统观察急性肺损伤大鼠模型肺组织中NF－κB p65的表达，证明LPS信号传导通路激活NF－κB，进一步探讨中药通腑汤对NF－κB的作用，阐述通腑汤对本病的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 Wistar清洁级大鼠60只，购自哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心，体质量(230±20)g。实验大鼠饲养在23℃，黑夜和白昼各12h的环境中，适应性喂养3天后用于实验。手术前禁食12h，但不禁水。

1.2 主要试剂及药物

冻干精制大肠肝菌内毒素脂多糖(LPS);通腑汤:主要药物(大黄、枳实、厚朴、杏仁、黄芩、甘草);地塞米松;4%甲醛、石蜡、乙醇、苏木精、伊红;浓缩型DAB试剂盒及PV6001二步法免疫组化试剂盒等。

2 实验方法

2.1 分组，动物模型的建立，给药方法 参考已发表文献［2－3］。

2.2 标本的采集及相关指标检测 于给药后第2h，用5%戊巴比妥钠20mg/kg对大鼠进行麻醉，取右肺中叶组织固定于4%多聚甲醛中，用于免疫组化检测NF－κB，并采用免疫组化(PV二步法)检测(严格按照说明书进行操作)，用美国Universal Imaging Porporation专用图像分析系统进行处理，在每个时间点选取3张，每张切片随机选取5个视野，用Meta Morph软件对阳性细胞的光密度进行分析。

2.3 统计学处理

全部数据均采用SPSS 16.0进行处理，结果用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

3 结果

通腑汤对各组大鼠肺组织中NF－κB p65表达的影响 结果见表1，图1～6。

表1 肺组织NF－κB p65表达图像分析结果(±s)

表1 肺组织NF－κB p65表达图像分析结果(±s)

注:与正常组比较，△P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.01;与地塞米松组比较，☆P ＜0.05，★P ＞0.05;与通腑汤低剂量组比较，※P ＜0.05;与通腑汤中剂量组比较，◇P＞0.05。

组别 n 光密度值正常组10 43.53 ±3.78模型组 8 181.96 ±17.57△地塞米松组 9 129.35 ±15.12*通腑汤低剂量组 10 145.85 ±7.81＊☆通腑汤中剂量组 9 131.63 ±12.51＊★※通腑汤高剂量组 10 127.52 ±11.76＊★※◇

4 讨论

4.1 通腑汤对ALI大鼠模型NF－κB p65的影响

在静止细胞中，NF－κB与其抑制因子在一起形成复合体，从而以无活性形式存在于细胞浆。当细胞受到内毒素刺激后，NF－κB抑制因子即发生磷酸化和降解，使NF－κB游离并进入细胞核，与目的基因结合位点结合，并启动基因转录。而活化的NF－κB迁移至核内，在核内NF－κB核转录因子又可诱导众多炎症相关的特异基因如TNF，IL－6，IL－8等的表达。在正常细胞中，NF－κB以无活性形式存在于细胞浆，如本实验中正常组所表现，免疫组化结果呈弱阳性免疫反应，阳性免疫反应产物多分布在胞浆中，胞核中极少见或没有阳性免疫反应物质，支气管壁及肺组织仅见少量散在的NF－κB阳性细胞，主要位于气道黏膜上皮细胞及血管内皮细胞，肺间质中几无NF－κB阳性细胞表达(见图1);模型组与正常组相比，NF－κB p65呈强阳性免疫反应(P＜0.05)，阳性免疫反应产物不仅分布在阳性细胞的胞浆中，细胞核中的阳性蛋白表达也呈强阳性，并可见明显的细胞核易位(见图2)，表明NF－κB p65已活化，说明 LPS致 ALI后，大鼠肺组织中NF－κB p65蛋白的表达在受到LPS刺激后被迅速活化，并立即进入细胞核中，与目的基因的启动子或增强子结合，诱导了基因的表达，使炎性细胞因子增加，参与炎症的发生。在治疗组中(见图3～6)，在胞核中阳性反应减轻，在胞浆中弱阳性表达，呈淡棕色，表明地塞米松及通腑汤均可下调NF－κB基因转录从而抑制NF－κB p65蛋白水平的表达，其中，以高、中剂量组下调明显，与地塞米松组相当，而低剂量组则不及上三组。

既往研究发现，ALI中存在着明显的NF－κB激活［4］，本实验也证实了这一点，从而证实了NF－κB的异常激活参与了急性肺损伤的发生、发展过程。NF－κB通过诱导促炎性细胞因子产生，引起炎症反应失控，导致组织损伤，参与ALI发生。通腑汤及地塞米松均可以减少NF－κB p65的激活，降低NF－κB p65的蛋白表达，从而减轻ALI早期炎症反应失控，减轻组织器官损伤，达到对ALI的保护作用。

4.2 通腑汤方药分析

通腑汤是依据中医学理论，以通腑除满、清肺平喘为法而组方的纯中药制剂。中医学认为，本病的主要病机为肠阻肺壅。当邪热入阳明，腑实热结，腑气不通，致痞满燥实形成，浊气不能下趋，反上逆于肺，致肺气不利，肺失宣降，故见喘促、气粗、肺气郁闭，宣降失常，则津停成痰，或致痰热阻肺，热毒壅盛而灼伤肺络。方中大黄味苦性寒，即能泻下攻积，又能清热泻火，且在方中用量最大，故为君药。积滞内阻，致使腑气不通，故用枳实辛行苦降，即能破气除痞以治气滞，又能消积导滞以助大黄攻下，为臣药。厚朴辛以行气，消腑气不通之胀满;苦以降气，助大黄推陈出新之功;且厚朴能燥湿化痰，下气平喘，针对肺气不降之咳喘有降气之功，亦为臣药。杏仁降气平喘，以助厚朴;肺主宣发肃降，其性有开有合，杏仁味苦能降，兼有疏利开通之性，降肺气之中兼有宣肺之功，以顺应肺性;且杏仁有润肠通便之效，以助大黄，为佐药之用。肺为娇脏，肺中有热以致肺不能宣发肃降而出现咳喘，故用黄芩清肺热以止咳喘，亦为佐药。方中药物寒温不和，故用甘草调和药性，为使药之用，全方共奏通腑泻热，降气平喘之功。

图1 正常对照组肺组织NF－κBp65蛋白表达(200×)

图2 模型组肺组织NF－κBp65蛋白表达(200×)

图3 地塞米松组肺组织NF－κBp65蛋白表达(200×)

图4 通腑汤低剂量组肺组织NF－κBp65蛋白表达(400×)

图5 通腑汤中剂量组肺组织NF－κBp65蛋白表达(200×)

图6 通腑汤高剂量组2肺组织NF－κBp65蛋白表达(200×)

［1］ 中华医学会呼吸病学分会.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的诊断标准(草案)［S］.中华结核和呼吸杂志，2000，23(4):203.

［2］ 刘晓东.通腑汤对急性肺损伤大鼠肺、肠组织TGF－β1的影响［D］.哈尔滨:黑龙江中医药大学，2010.

［3］ 李竹英，刘琳，李传钰.通腑汤对急性肺损伤大鼠NF－κB mRNA的影响［J］.中医药学报，2011，39(6):32 －34.

［4］ 金婧.LPS致新生大鼠急性肺损伤促炎性细胞因子抗炎性细胞因子和NF－κB变化及N－乙酰半胱氨酸干预作用的研究［D］.沈阳:中国医科大学，2004.