和解聚散方对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织α－SMA表达的影响

崔瑾，王耀献，孙卫卫，刘尚建，沈存，吕杰，王晓楠

(北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

肾间质纤维化是多种慢性肾脏病发展到终末期肾病的共同途径。它以过量细胞外基质在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。肾小管间质受损时，小管细胞转分化为成纤维细胞，随着病变的加重，继而转变表型为肌成纤维细胞，并以α－SMA表达为特征［1］。因此，α－SMA是衡量肾小管间质纤维化的重要指标。

和解聚散方是王耀献教授根据多年临床经验总结得出，从已经完成的动物实验和临床观察的结果证实，和解聚散方能够改善肾功能，延缓终末期肾脏病进程［2－4］。基于以上理论及前期研究结果，本文拟重点探讨和解聚散方抗肾纤维化的作用机制是否与抑制大鼠肾组织α－SMA的表达有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠120只(体质量180～220g，购自维通利华实验动物公司)，适应性喂养1周，随机分为4组:I组假手术组，II组模型组，III组洛丁新组，IV组和解聚散方组，各30只，供给清洁大鼠饲料，自由饮水、进食，每笼5只，保持笼内清洁。

1.2 试验药物 和解聚散方由黄芪、当归、海藻、牡蛎、穿山甲等药物组成，来源于东直门医院中草药药房，由北京中医药大学中药学院制成煎剂，浓缩后高温消毒封装备用，浓度为每毫升含生药1g。洛丁新(盐酸苯那普利)购自北京诺华制药有限公司。

1.3 造模及给药方法 采用右侧输尿管结扎手术制备UUO模型，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组以5%的水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择背部正中线肋脊角旁开1cm切口，依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，将右侧输尿管结扎，然后连续缝合皮肤。假手术组手术入路方式同模型组，进入腹腔后分离右输尿管但不结扎输尿管。造模术后24h开始分别灌胃，Ⅰ、Ⅱ组灌胃生理盐水(3ml/只)，Ⅲ组灌胃洛丁新(1.0mg/kg/d)，IV 组灌胃和解聚散方(9.8g/kg/d)。每组10只大鼠分别于造模术后第7、14、21天处死，留取梗阻侧肾组织备用。

1.4 试剂 α－SMA小鼠来源单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);DAB显色试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司);两步法免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 肾组织病理检查 取梗阻侧肾组织，以4%多聚甲醛固定后，脱水、浸蜡、石蜡包埋，切成3μm厚度的石蜡切片，分别行HE染色及Masson染色，光镜下观察肾脏皮质区及皮髓交界区肾小管、肾间质的结构变化。

1.5.2 免疫组化检测 使用两步法免疫组化试剂盒，操作步骤按试剂盒说明进行，PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素轻度复染，采用光学显微镜(400×)观察皮质肾小管间质区α－SMA的表达，以光镜下细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性信号。半定量分析采用Image Pro plus 6.0多媒体彩色病理图像分析软件。光镜下在皮质区选取10个不重叠视野，尽量避开肾小球和血管，计算阳性表达面积占总面积的百分比。

1.6 统计学处理 所有数据均以均值±标准差表示。采用SPSS 13.0计算机软件对所得数据进行分析，计量资料的比较采用单因素方差分析，P＜0.05视为有统计学差异。

2 结果

2.1 病理学改变 HE、Masson染色观察可知，假手术组肾间质无纤维化;模型组出现肾间质炎细胞浸润，间质水肿，且伴有不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及肾小管灶状萎缩，小管管腔闭塞和/或扩张，部分肾小管腔内有蛋白或细胞管型，间质纤维化;洛丁新组、和解聚散方组病理变化较模型组减轻。

2.2 免疫组织化学和半定量分析 假手术组中α－SMA只在肾组织血管壁上表达;模型组、洛丁新组、和解聚散方组除血管壁上有表达外，可见大量阳性表达出现在肾间质细胞胞浆中，同时部分小管上皮细胞胞浆内也出现阳性染色颗粒。半定量分析显示，模型组、洛丁新组、和解聚散方组中α－SMA在术后7天、14天、21天表达均明显高于假手术组(P＜0.05)，两个治疗组的表达水平明显低于模型组(P＜0.05)，和解聚散方组14天与洛丁新组14天比较有显著性差异(P ＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肾小管间质α－SMA表达的比较(±s)

表1 各组大鼠肾小管间质α－SMA表达的比较(±s)

注:与假手术比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05;与洛丁新组比较，△P＜0.05;与同组第7天比较，★P＜0.05;与同组第14天比较，▲P ＜0.05。

组别 时间(天) α－SMA阳性表达面积(%)0.039 7 ±0.024 85模型组 7 5.890 9 ±2.051 74*14 7.380 9 ±2.256 39*21 10.684 8 ±3.390 23＊★▲洛丁新组 7 2.419 7 ±0.731 51*#14 4.843 0 ±3.042 69＊★21 3.660 8 ±1.359 94*和解聚散方组 7 1.856 1 ±1.305 75*#14 1.940 8 ±0.882 11*#△21 2.204 4 ±0.317 02*#假手术

3 讨论

UUO模型是目前公认的较为成熟的一种研究肾小管间质纤维化的实验动物模型。输尿管结扎后随着病变进展，间质纤维化形成，最终导致整个肾脏弥漫性损害，在本实验中亦得到证实。

α－SMA作为一种细胞骨架蛋白，广泛分布于平滑肌、肌上皮细胞、周细胞和一些基底细胞中，正常肾脏中仅有血管平滑肌细胞强阳性表达α－SMA，其它细胞通常不表达α－SMA。在肾小管间质纤维化发生发展中肌成纤维细胞出现，并在ECM过度沉积，该细胞主要表达α－SMA，α－SMA是肌成纤维细胞激活的特异性标志物。

肾组织α－SMA表达增高，表明肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、间质成纤维细胞这些肾脏固有细胞被激活和异常增殖，具有肌成纤维细胞特性，合成和分泌细胞外基质增多，参与肾脏的纤维化。即这些细胞发生了细胞表型转化，由静止表型转化为增殖表型或分泌表型。

肾纤维化的中医病机是“肾络微型癥瘕”形成，消癥散结在肾纤维化的治疗中具有重要意义。王耀献教授创立和解聚散方，并以此加减治疗慢性肾脏病，在临床中取得了较好疗效。和解聚散方由黄芪、当归、海藻、牡蛎、穿山甲等药物组成，方中以黄芪、当归为君，补血活血，补气扶正;穿山甲，海藻，牡蛎为臣，消癥散结，诸药共奏和解聚散，扶正通络之功。全方虚实并调，标本兼顾，为治疗肾纤维化的有效方剂。现代药理研究证实，黄芪能清除氧自由基，通过抑制TGF－β产生，减少ECM生成，调节细胞免疫及体液免疫，降低尿蛋白，保护肾功能［5－6］。黄芪当归合剂可明显抑制大鼠肾小球内和肾小管间质部位α－平滑肌肌动蛋白的表达，下调JNK信号通路活化，从而抑制肾小球MsC表型转化［7－8］。

本实验结果表明，和解聚散方能够降低UUO大鼠肾组织中α－SMA的产生，减缓肾纤维化的发展。充分说明了和解聚散方具有良好的抗肾纤维化作用，抑制肾脏固有细胞表型转化及α－SMA的表达是其抗肾纤维化的机制之一，也说明了本方是一种防治延缓慢性肾脏病进展的有效中成药物，有必要进行深入研究和临床推广应用。

［1］ 付平，张翥，冯梅，等.苦参碱对肾小管间质CTGF和α－SMA影响的实验研究［J］.四川医学，2005，26(10):1074 －1076.

［2］ 王耀献，刘尚健，孙鲁英，等.肾炎防衰治疗慢性肾小球肾炎60例临床观察［J］.中国中药杂志，2005，30(7):555 －556.

［3］ 王耀献，刘尚健，赵宗江，等.肾炎防衰液对单侧输尿管梗阻大鼠的治疗作用［J］.中国中药杂志，2005，30(10):796 －797.

［4］ 王耀献，刘尚健，赵宗江，等.肾炎防衰液对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏保护作用［J］.中医药学刊，2005，23(3):26 －28.

［5］ 张翥，方敬爱，叶任高.中药的肾保护与肾毒性［J］.中国中西医结合肾病杂志，2001，2(9):552 －553.

［6］ 王收宝，田林红.黄芪治疗糖尿病肾病分子机制研究进展［J］.中医药学报，2011，39(1):118 －121.

［7］ 王荣，李晓枚，李惊子，等.黄芪当归合剂对慢性肾病鼠肾脏细胞表型及MAPK信号传导通路的影响［J］.中国药理学通报，2003，19(9):1069－1074.

［8］ 涂玥.中药防治糖尿病肾病在基因表达水平上的研究进展［J］.中医药学报，2011，39(5):93 －96.