活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达的影响

白云，李洋，章艳

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑血管病是一种以“发病率高、致残率高、死亡率高”为特点的严重威胁人类，尤其是中老年人健康的常见病、多发病。据近年流行病学调查表明，我国每年死于脑血管病大约100万人，其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。因此，缺血性脑血管疾病日益受到医药学界的重视［1］。目前普遍认为，脑缺血是由多种作用机制共同作用的结果，中药以其多成分、多靶点的特点在脑缺血的防治中具有独特优势［2］。活血熄风方是以祛风活血中医理论指导下提出的新组方。本文旨在通过观察活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质cfos蛋白表达的影响，探讨其神经保护作用机制，并为研发作用机制明确的防治脑缺血中药新药奠定实验基础。

1 实验材料

Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(300±20)g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。活血熄风方(按常规方法制成水煎液，4℃保存备用)［3］;银杏叶片(唐山荣大药业有限公司);尼莫地平片(西安博爱制药有限公司);PV6001二步法检测试剂盒(北京中杉金桥);c－fos抗体(美国SANTA Cruz公司);Q500IW图像分析仪(德国Leica);光学显微镜(Olympus Japan BH －2)。

2 实验方法

Wistar大鼠随机分成7组，为活血熄风方高剂量组(活血熄风方10g/kg)、中剂量组(活血熄风方5g/kg)、低剂量组(活血熄风方2.5g/kg)、尼莫地平组(尼莫地平片21.6mg/kg)、银杏叶片组(银杏叶片135mg/kg)、模型对照组和假手术组(蒸馏水2ml/只)。各组均灌胃给药7天，末次给药后30min采用 Longa［4］方法，制备大鼠MCAO模型。待大鼠意识恢复后30min后，对其进行神经功能缺损评分，评分在1～3分者纳入研究。行为学评分后，各组大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，随后开胸剪开右心耳，从左心室插管至升主动脉，迅速灌注约150ml肝素化生理盐水，随后缓慢灌注0.1mol/L磷酸缓冲液200ml(含4%多聚甲醛)。用剪刀从枕骨大孔剪开，完整取大脑，制作病理组织片，并按照常规免疫组化法检测各组大鼠脑皮质c－fos蛋白的表达。在缺血周边区脑皮质选择5个非重叠视场，于100倍光镜下计数阳性染色细胞数。实验结果采用SPSS 11.5 for Windows统计软件分析处理，采用Test检验。

3 实验结果

免疫组化法检测活血熄风方对模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达的影响，实验结果见表1。

表1结果显示，在24h、48h和72h不同时间点，模型对照组与假手术组比较，c－fos蛋白表达均显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)。在24h和48h时间点，活血熄风方高、中剂量组、尼莫地平组、银杏叶片组分别与模型对照组比较，c－fos蛋白表达均有不同程度的降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在72h时间点，活血熄风方高剂量组、尼莫地平组与模型对照组比较，c－fos蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 活血熄风方对模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达的影响(n=10，±s)

表1 活血熄风方对模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达的影响(n=10，±s)

注:各组与模型对照组比较，*P＜0.05;模型对照组与假手术组比较，▲P＜0.01。

组别 剂量(mg/kg)个非重叠视场24h 48h 72h活血熄风方高剂量组 10 18.31 ±3.26* 8.88 ±1.25* 5.92 ±1.34阳性细胞表达数(个)/5*活血熄风方中剂量组 5 16.18 ±3.41* 9.89 ±1.87* 6.95 ±1.03活血熄风方低剂量组 2.5 20.34 ±5.15 11.69 ±2.85 7.05 ±3.75银杏叶片组 135 16.15 ±3.21* 8.23 ±1.16* 7.95 ±1.21尼莫地平组 21.6 14.27 ±3.44* 7.23 ±1.69* 5.12 ±0.39*模型对照组 － 22.10±3.39▲ 12.80±2.50▲ 8.38±2.41▲假手术组4.43 ±0.89 3.82 ±0.86 4.12 ±0.84－

4 讨论

脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病。近年来，对缺血性脑损伤发生的病理生理机制研究正在不断深入。目前认为，缺血性脑损伤的发生是由炎症反应、自由基损伤、酸中毒和细胞凋亡等多种病理生理机制引发的复杂的级联反应过程，因此寻找一种安全有效且能够阻断或减弱缺血性脑损伤级联反应各个环节的神经保护药物，也成为各国学者研究的热点。尽管西药中神经保护药物种类繁多，但由于临床疗效有限和不可避免的毒副作用，限制了其临床应用。而中医药具有整体调节和多环节综合治疗的优势，在防治缺血性脑损伤研究中显示了较好的疗效。活血熄风方是中医理论指导下提出的新组方，全方以活血化瘀为主，能降低血管的张力，减轻脑动脉压力。

c－fos是即刻早期癌基因(immediate－early genes，IEGs)中研究最多的一种原癌基因，作为细胞核第三信使分子与c－fos蛋白结合调控转录活性，参与包括缺血性脑损伤在内的多种病理反应过程［5］。本研究发现，活血熄风方在24h和48h时间点，活血熄风方高、中剂量组能够降低模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达。在72h时间点，活血熄风方高剂量组能降低模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达。由此推测，活血熄风方对缺血性脑损伤的保护作用可能与其降低模型大鼠脑皮质c－fos蛋白表达有关。其确切作用尚需通过进一步实验进行验证。

［1］ 周鸿雁，毛海峰，王一蓉，等.脑缺血损伤的研究进展［J］.湖南文理学院学报:自然科学版，2005，17(2):72 －75.

［2］ 胡伟东，胡耀祖，黄小平.中药有效成分对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究进展［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18(1):92－95.

［3］ 白云，颜培宇，梁颖.活血熄风方对MCAO局灶性脑缺血模型大鼠脑皮质ICAM－1蛋白表达的影响［J］.中医药学报，2011，39(1):13－15.

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Revesible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84 －91.

［5］ 王岩，黄久仪.c－fos原癌基因表达在脑缺血方面的研究进展［J］.上海医学，2006，29(3):189 －191.