中药复方抗痫灵对戊四氮致痫大鼠脑组织海马凋亡相关因子C－fos蛋白表达的影响

王国才，杨见民，车琳琳，王小东

(1.黑龙江省卫生厅，黑龙江 哈尔滨 150090;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

癫痫与中医学中“痫病”概念是一致的。以突然意识丧失，发则仆倒，不省人事，两目上视，口吐涎沫，四肢抽搐，或口中怪叫，移时苏醒，一如常人为主要临床表现的一种发作性疾病。又有“痫证”、“癫痫”、“羊痫风”之称。现代医学认为，癫痫的发病机制极为复杂，影响因素颇多，迄今为止尚未完全阐明。在正常情况下，C－fos mRNA蛋白在中枢神经中有低水平表达［1－2］。但在机体受到机械、化学、缺血性脑损伤后，C－fos mRNA和 fos蛋白的表达水平有很大的变化［1－4］，尤其是各种致痫刺激能使C－fos mRNA和fos蛋白的表达产生明显的变化，但这种表达具有刺激特异性、细胞特异性和时程特异性［5］。在癫痫发作时C－fos则快速一过性高表达，海马为主要部位之一。通过检测C－fos mRNA蛋白已广泛用于判别抗癫痫药物或其他相关因素在抗癫痫治疗中的作用机制和疗效［6］。中医学则对痫病的认识由来已久，早在战国时代的医家就对痫病有一定的认识，虽然未给痫病以明确的定义，但至少它已经认识到痫病是一种脑病，且与先天因素有关。认为痫病系指脏腑受伤，神机受累，元神失控所致。中医历代医家对痫病的病因病机观点不一，近年来多认为与痰、气、风、火、瘀血等因，并与情志有关，是由于正气不足，脏腑经络的功能低下所致，即病性属本虚标实，正气亏虚为其本［7－8］。故以活血化痰开窍，熄风镇惊安神为法组成中药复方抗痫灵，观察其对戊四氮致痫大鼠脑组织海马凋亡调控因子C－fos等表达水平的影响，从分子生物学水平探讨中药复方抗痫灵治疗癫痫的可能作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 受试药物

1 )中药组方:由穿山甲、龙骨、乳香、没药、珍珠、胆南星组成。各药为末混合。药材购于黑龙江中医药大学专家门诊。

2 )西药阳性对照药:丙戊酸钠缓释片，由江苏恒瑞医药股份有限公司生产;批号:081017;规格:20mg。研磨后用生理盐水配制成悬浊液，用时摇匀，冰箱保存备用。

3 )致痫药物:戊四氮(pentylenetetrazoze，PTZ):购自美国Sigma公司，运用电子天平精确称取PTZ粉末，用前1h溶于生理盐水新鲜配制。

1.2 实验动物

实验动物由黑龙江中医药大学实验动物中心提供的健康的雄性Wistar大鼠共90只(SPF级，体质量为180～220g，在通风、湿度、温度适宜的实验室中常规饲养，自由摄食、饮水1周，其中80只用于造模，造模成功后用于下一步实验，10只用于设立实验空白对照组。

1.3 主要仪器及设备

X－22台式低温高速离心机(德国 LEICAVLTRACUT公司);TA1003电子精密天平(上海天平仪器厂);LKB－NOVA型超薄切片机(瑞士);OLIMPUS图像拍摄系统(日本OLIMPUS公司);HPIAS－1000型医学彩色全自动图像分析仪(北京);－70℃低温冰箱MDF330型(日本 SANYO公司);4℃冰箱(BCD－218A/B型，青岛海尔股份有限公司);FBG－1型生物实验屏蔽柜(成都仪器厂);RNA浓度测定仪(姜堰市康健医疗器具公司);电热恒温水浴箱(日本HITACHI公司);DU－640型蛋白质核酸分析仪(美国BECKMAN公司);DYY－SB电泳仪(北京医疗设备厂);PCR仪PTC－200型(日本MJ公司);紫外可见凝胶检测成像系统(北方医疗设备厂);SW－CJ－ID型医用超净工作台(长沙光大科学仪器有限公司);HANNAPH211型酸度计(上海第三分析仪器厂);ZDX－35型坐式电热蒸汽压力锅(上海申安医疗器械厂);实验室电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂);DK－SB型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);YDS－10型液氮罐(成都金凤液氮容器有限公司)。

1.4 主要试剂

免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司);多聚赖氨酸(北京中杉金桥生物技术有限公司);浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);逆转录试剂盒(美国Roche公司);Sybr荧光定量PCR试剂盒(Roche);TaqDNA聚合酶(大连宝生物有限公司);总RNA提取试剂盒(华舜);10×RNA Buffer(大连宝生物有限公司);琼脂糖(Amresco公司);PCR引物(上海英骏生物技术公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组

实验分设6组。其中由戊四氮所诱导的癫痫大鼠63只随机分成5组，设癫痫模型组(13)、丙戊酸钠治疗组(12)也即西药对照组、抗痫灵低剂量治疗组(13)，抗痫灵中剂量治疗组(13)，抗痫灵高剂量治疗组(12)。另设正常对照组10只。

2.2 造模方法［9－10］

采用戊四氮(PTZ)腹腔注射(iP)法，每日上午9∶00～11∶30腹腔注射戊四氮(ipPTZ)，注射剂量按亚致痉量35.0mg/kg标准。

2.3 给药方法

正常对照组和癫痫模型组灌服相应量生理盐水，其它各组给予药物灌胃治疗。每日固定时段灌胃给药1次，连续灌胃治疗6周。实验期间各组均以普通饲料饲养，并自由饮水。

灌服药物的剂量按正常成人(70kg)与大鼠给药剂量系数(0.018)折算。

临床丙戊酸钠用量一般为20～30mg/kg，取其25mg/kg的剂量，换算成大鼠灌胃剂量为15.75mg/kg。

中药抗痫灵低剂量组为0.25g/kg(为正常用量的1/2);中药抗痫灵中剂量组0.5g/kg(为正常用量);中药抗痫灵高剂量组1g/kg(为正常用量的1倍)。

2.4 灌注及取材

在冰冻的蜡块上操作，取脑，修块，在大脑视交叉与视乳头之间冠状切取组织块，断面可见白色纤维状物，即是海马。用钝的刀片剥离左右海马。一部分放入EP管中迅速投入液氮供Real time PCR使用。另一部分置于4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，供免疫组化使用。

3 观测指标测定

3.1 免疫组化方法检测大鼠脑组织中海马C－fos蛋白的表达

免疫组化采用非生物素二步法免疫检测试剂盒。此试剂盒具有简单、快速、敏感等特点，因为系统中不再使用生物素，所以避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。统计阳性目标面密度值，取其平均值。按试剂盒说明操作。

3.2 实时荧光定量PCR(Real time PCR)方法检测大鼠海马组织C－fos mRNA的相对表达

PCR技术是一种体外扩增DNA或RNA片段的方法，PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

表1 引物序列及扩增子长度

图1 各组大鼠海马组织c－fos增产物凝胶电泳图

3.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。所有数据以均数±标准差(±s)表示，两两比较用q检验，同组前后比较用配对t检验。

4 实验结果

4.1 免疫组化方法检测各组大鼠脑组织C－fos的表达

用图像分析方法。采用 CMIAS系列 Motic.Med6.0数码医学图像分析系统测量阳性目标的面密度值。每张切片随机选择5个200倍视野，经显微镜摄像系统输入计算机，选择免疫组化分析模块，对实验结果进行分析，结果见表2。

表2 各组大鼠脑组织中海马C－fos蛋白阳性目标面密度值比较(±s)

表2 各组大鼠脑组织中海马C－fos蛋白阳性目标面密度值比较(±s)

注:与空白组比较，※P ＜0.01;与模型组比较，★P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，◆P ＞0.05。

组别 n 阳性目标面密度值空白组 10 0.016 253 ±0.007 551★模型组 10 0.071 570 ±0.018 459※西药组 12 0.030 957 ±0.004 800▲中药低剂量组 11 0.048 194 ±0.010 082◆中药中剂量组 12 0.038 886 ±0.030 121▲中药高剂量组 12 0.035 819 ±0.019 931▲

由表2所示，模型组大鼠海马中C－fos mRNA表达显著增加，与正常对照组比具有显著性差异(P＜0.01);各治疗组大鼠治疗后海马中C－fos mRNA表达，较模型组均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但均未达到空白组的水平(P＜0.01)。从数值上看，西药组治疗效果优于中药高、中、低剂量组，但各治疗组之间相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

4.2 TUNEL法检测各组大鼠脑组织海马的细胞凋亡与半定量分析 结果见表3。

表3 各组大鼠脑组织海马凋亡细胞面密度值比较(±s)

表3 各组大鼠脑组织海马凋亡细胞面密度值比较(±s)

注:与空白组比较，※P ＜0.01;与模型组比较，★P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，◆P ＞0.05。

组别 n 凋亡细胞面密度值空白组 10 0.002 287 ±0.000 288★模型组 10 0.004 834 ±0.000 657※西药组 12 0.002 308 ±0.000 407★中药低剂量组 11 0.004 136 ±0.000 639◆中药中剂量组 12 0.003 298 ±0.000 987▲中药高剂量组 12 0.002 797 ±0.000 295★

由表3所示，模型组大鼠海马区凋亡细胞面密度值显著高于空白组(P＜0.01)，各治疗组大鼠海马凋亡细胞面密度值明显高于空白组，低于模型组，各治疗组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。中药高剂量组和西药组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);中药中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);中药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

5 讨论

本实验通过戊四氮(PTZ)致痫大鼠模型，运用光镜、免疫组化、TUNEL法、Real time PCR等技术，对比观察了各组大鼠的脑组织海马病理形态结构、海马神经元细胞凋亡、海马组织C－fos mRNA的相对表达等指标的变化，探讨活血化痰开窍，熄风镇惊安神法抗痫的可能作用机制。结果表明，中药复方抗痫灵能有效减少癫痫的发作频率，降低其发作程度。高、中剂量的中药复方抗痫灵、西药丙戊酸钠均对癫痫大鼠有良好的治疗作用，各组间无显著性差异，皆能成功控制癫痫大鼠的痫性发作，对癫痫大鼠的脑电图有改善作用。而低剂量组的抗痫灵未能成功控制癫痫大鼠的癫痫发作，可能与药物剂量不足有关。中高剂量的中药复方，西药能显著降低癫痫大鼠大脑海马的C－fos表达，低剂量的中药复方降低大脑海马C－fos表达不明显，中药复方的抗痫作用机制可能与降低脑内C－fos表达水平有关。

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