杏鲍菇单孢诱变杂交及其子代的鉴定

汤倩倩，李 明*，李守勉，田景花，周晓东，陈苗苗

（河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001）

同工酶技术已被广泛应用于食用菌遗传育种和分类鉴定，酯酶同工酶是同工酶研究中最稳定、易检测的酶系统之一[7]，酯酶同工酶技术已应用到杏鲍菇菌株之间遗传分析、亲缘关系分析以及杂交菌株的鉴定上[8-10]。通过对杏t菌株的单核菌丝诱变杂交获得新的子代菌株，并将亲本杏t与子代菌丝进行酯酶同工酶电泳分析，筛选出具有较强杂种优势的子代新菌株，为菌丝体和子实体阶段的进一步筛选提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

杏t，由河北农业大学食用菌研究室保藏。

1.1.2 培养基

PDA培养基：土豆 （去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL，pH自然母种培养基：棉籽壳200 g、土豆 （去皮）100 g、麸皮 20 g、葡萄糖20 g、蛋白陈5 g、琼脂20 g，水1 000 mL， pH自然

1.2 方法

1.2.1 单孢稀释分离及诱变处理

采摘八成熟的杏t子实体收集孢子，用连续稀释法分离孢子，孢子悬浮液浓度约为106个·mL-1，用玻棒均匀涂于PDA平板培养基上，25℃恒温培养。待孢子刚刚萌发，置于30W紫外灯正下方30 cm处进行诱变处理，照射时间分别为10 s、 30 s、 1 min、 1.5 min、 2 min、 3 min，再于25℃黑暗条件下继续培养3 d~5 d。

1.2.2 配对杂交

经诱变的单孢子暗培养后，选择发育良好的单核菌丝，两两配对接种于PDA平板培养基上，相距1.0 cm~1.5 cm，25℃培养9d左右，待菌丝接触后，挑取交界处部分菌丝镜检，若有锁状联合则转接于斜面母钟培养基上培养，淘汰菌落形态不均一，生长较弱的菌株。

1.2.3 拮抗试验

在母种平板培养基上接种亲本和杂交子代菌丝体，两者相距4 cm，25℃恒温培养，观察是否有明显拮抗线产生。

1.2.4 亲本及诱变杂交子代的酯酶同工酶分析

酶液提取方法按参考文献9（王俊玲等）的方法进行。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为3.75%,电极缓冲液为Tris-Gly系统,浓缩胶电压120 V，分离胶电压180 V，在4℃条件下电泳。胶条取出后用α,β-醋酸萘酯-坚牢兰RR盐法染色，并用7%醋酸固定。

2 结果与分析

2.1 单核菌丝的诱变杂交

如图1所示，长势较好的杏t单核菌丝 (箭头所指)纯白浓密，气生菌丝发达，爬壁旺盛，但相对双核菌丝生长速度很慢。

图1 单核、双核菌丝对比

经镜检，获得16个无锁状联合的单核菌株 （如图2），两两配对后能连成一片，表示杂交亲和，挑取交界处菌丝镜检，将有锁状联合的双核菌丝 （如图3）转接于母种斜面培养基上，选取了47株生长速度快、边缘整齐、纯白浓密的优良子代。

2.2 拮抗线检测

图2 单核菌丝镜检图

图3 双核菌丝镜检图

将杂交组合分别与其亲本进行拮抗试验，其中有17个杂交菌株与亲本能融合生长，无拮抗线产生，说明是同种菌丝；30个杂交菌株与其亲本有明显拮抗线 （如图4），说明不是同种菌丝，为杂交新组合，随机编号为Z1、Z2、Z3、 Z4…Z30。

2.3 杂交子代与亲本酯酶同工酶电泳分析

图4 拮抗反应

杂交子代酶谱如果与亲本相似，则同源性强，若杂交子代酶谱中出现 “杂种新酶带”或 “互补酶带”，杂种新酶带一般1条～2条，则杂交子代杂种优势强；若杂交子代谱带减少，一般减少2条～3条，且无杂种新酶带出现，则杂交子代杂种优势较弱。

酯酶同工酶电泳图谱及模式图如图5、图6所示，亲本 （箭头所指）及30个杂交子代菌株中，共检测到10条迁移率不同的酶带，Rf值在0.081~0.707之间，其中共同酶带一条，Rf值为0.535，可认为是杏鲍菇的特征酶带。根据亲本与子代酯酶同工酶谱带相对迁移率推测 （见表1），菌株 Z6、 Z13、 Z16、 Z18、 Z22、 Z25、 Z26都有新酶带出现，可以认为这7个诱变杂交子代的杂种优势较强。其中子代Z26和亲本杏t相比，除共有的9条酶带外，在Rf 0.167处多了一条新酶带。

图5 杂交子代与亲本酯酶同工酶电泳图谱

图6 杂交子代与亲本酯酶同工酶电泳模式图

3 讨论

本研究采用生理状态一致、充分分散的单核菌落进行诱变处理，使细胞能均匀地接触诱变剂，同时减少了分离性表性延迟现象的发生。将单核菌落用不同诱变时间处理，从中挑选出生长速度快、长势旺盛的单核体菌株进行配对杂交，以期选育出优良的杂交异核体。

同工酶技术成为菌株分类鉴定重要手段的同时，也广泛应用于食用菌遗传变异、亲缘关系分析及育种中的菌株特性预测等研究[11]。将杏鲍菇菌丝体进行酯酶同工酶酶谱分析，在相同的测定条件下重复性好。菌株在子实体尚未形成之前进行菌丝体的酯酶同工酶分析，为早期鉴别诱变菌株提供了一种快速、可靠、简便的方法，能够简单而快速测出亲本与子代菌株分子水平的差异。通过对亲本杏t及其诱变杂交子代菌丝体的酯酶同工酶酶谱分析，预测子代出现强优势菌株有 Z6、Z13、Z16、Z18、Z22、Z25、Z26，但对其生物性状稳定性、子实体经济性状、生物转化率等还需进一步研究。

表1 杂交亲本及其子代酯酶同工酶谱带相对迁移率

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