益肺活血颗粒对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞内低氧诱导因子-1α和活性氧的影响

张凌云，欧 敏，顾 珏，宋秀杰

低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α)是细胞为适应缺氧环境所产生的一种核转录因子。最新研究发现，HIF-1α与低氧肺血管收缩和低氧肺动脉高压联系紧密。HIF-1α蛋白的表达量和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节，缺氧时细胞内活性氧升高，并反馈性刺激HIF-1α的表达，可通过HIF-1α-瞬时受体钙离子通道和活性氧(reactive oxygen species，ROS)-蛋白激酶C等多个信号途径促进细胞内Ca2+浓度的升高和各种活性介质的生成，进而刺激肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的增殖和肺血管的收缩、重塑，导致肺动脉高压的不可逆性病理改变[1-2]。

目前，临床上尚无有效治疗肺动脉高压的方法。益肺活血颗粒是中医内科学家董建华院士在补中益气汤与血府逐瘀汤基础之上辨证加减而配制的一组中药复方，多年来一直应用于慢性阻塞性肺疾病及慢性肺心病的治疗，临床疗效显著。前期动物研究也发现该药具有保护血管内皮细胞、抑制中膜增厚、减轻血管缩窄、降低肺动脉高压的功能[3-4]。本研究着重观察该药对低氧培养大鼠PASMCs内HIF-1α和ROS的影响，从分子水平探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物 益肺活血颗粒(yifeihuoxue granule，YFHXG)，原始的未经加工干粉剂，钴60灭菌，海军总医院药剂科提供。

1.1.2 主要试剂与设备 达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM/F12 培养基(GIBCO 公司，美国)，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯 (2'，7'-dichlorfluorescein diacetate，DCFDA)探针(Molecular Probes公司，美国)，兔抗大鼠HIF-1α抗体(武汉博士德公司)，免疫组化试剂盒，3，3'-二氨基联苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)试剂盒(天津灏洋生物公司)，噻唑蓝[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]试剂盒(北京凯欣杰生物科技公司)，抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)。激光共聚焦显微镜(Beckman Coulter公司，美国)，缺氧CO2培养箱(Thermo公司，美国)，酶标仪(Bio-Tek公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备 20只SD大鼠雌雄各半，体质量50～150 g(中国医学科学院动物研究所提供)，随机分为4组:空白对照组和YFHXG高、中、低浓度组，每组5只。YFHXG各组每天2次分别以高浓度(16.5 g/kg)、中浓度(3.3 g/kg)、低浓度(0.66 g/kg)灌胃，空白组以同等量的生理盐水灌胃，连续7 d;末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)给药2 h后腹主动脉采血，离心后分离血清，合并同组含药血清，0.22 μm微孔滤膜过滤后，－80℃保存备用。

1.2.2 大鼠PASMCs原代培养和鉴定 选用成年SD大鼠10只，雌雄各半，体质量150～250 g。2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，无菌条件下取出心肺，轻柔分离肺动脉，在外科手术显微镜下仔细剥除肺动脉内、外膜，用眼科剪将肺动脉中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，接种于25 ml培养瓶中于37℃5%CO2培养箱中孵育，3～5 d换1次培养液(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。14 d后细胞爬出，呈典型峰、谷状分布，抗β-actin单克隆抗体免疫组化染色鉴定为肺动脉平滑肌细胞，纯度在98%以上。胰酶消化传代培养，采用生长良好的3～5代PASMCs进行实验。

1.2.3 实验分组 将生长良好的3～5代的PASMCc按实验分为5组:①常氧组(21%O2)，常氧条件下加入含10%空白药物血清的DMEM/F12培养液;②缺氧组(3%O2)，缺氧条件下加入含10%空白药物血清的DMEM/F12培养液;③缺氧+YFHXG高浓度组，缺氧条件下加入含10%高浓度(16.5 g/kg)药物血清的DMEM/F12培养液;④缺氧+YFHXG中浓度组，缺氧条件下加入含10%中浓度(3.5 g/kg)药物血清的DMEM/F12培养液;⑤缺氧+YFHXG低浓度组，缺氧条件下加入含10%低浓度(0.66 g/kg)药物血清的DMEM/F12培养液。

1.2.4 MTT法 将生长良好的3～5代PASMCs以每孔8×103/10 μl接种于96孔培养板，24 h后换不含胎牛血清的DMEM/F12同步化培养24 h，培养条件同上，按实验分组培养24、48、72 h。每孔加入MTT 10 μl，继续孵育4 h后直接加入甲瓒溶解液每孔100 μl，置于CO2培养箱再孵育4 h，用酶标仪于570 nm 处测定吸光度值(A570nm=A实验组－A空白组)，每组8个复孔，重复实验4次。

1.2.5 细胞内ROS浓度测定 将生长良好的3～5代PASMCs接种于6孔培养板，待细胞生长密度达70%时，按不同实验分组干预24 h后弃去培养液，加入适当体积稀释好的DCF-DA，充分覆盖细胞，避光置37℃孵育20 min后弃去染液，用无血清培养液DMEM/F12冲洗细胞3次，以充分去除未进入胞内的DCF-DA，再加入1 ml平衡液用于检测。将染色好的细胞置于倒置激光共聚焦显微镜下，设定好参数(激发波长为488 nm，发射波长为550 nm)，每组随机选取6个，每个样本选择3个视野进行摄像分析。结果利用控制软件image-pro plus 5.0进行荧光强度的测定，取DCF-DA的平均荧光强度反应细胞内ROS水平。

1.2.6 免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(streptomycin avidin-biotin-peroxidase connection，SP)法测定 HIF-1α蛋白含量 将生长良好的PASMCs悬液置于带有小盖玻片的6孔板中制作细胞爬片，按不同实验分组干预24 h后，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗3遍，加4%多聚甲醛固定10 min，PBS再冲洗3遍，依照SP试剂盒步骤进行。每组随机选6张爬片进行统计分析，每张爬片用HMIAS-2000高清晰度彩色病理图文分析系统分析，测量阳性细胞的平均灰度值。

1.3 统计学处理 数据处理采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示。采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PASMCs吸光度值变化 各组PASMCs分别培养24、48、72 h时，与常氧组相比，缺氧组吸光度值显著升高(P＜0.05)，PASMCs增殖明显，数目增多，且细胞向合成型转化。与缺氧组相比，缺氧+YFHXG高、中浓度组吸光度值显著降低，生长受抑制，数目减少，舒张明显，并且具有剂量依赖性(P＜0.05);而缺氧+YFHXG低浓度组对PASMCs的增殖无显著抑制作用(P＞0.05)。

表1 PASMCs吸光度值变化(n=8)

2.2 PASMCs内HIF-1α蛋白表达 与常氧组相比，缺氧组PASMCs内HIF-1α蛋白表达显著升高;与缺氧组相比，缺氧+YFHXG高、中浓度组细胞内HIF-1α蛋白显著降低，且具有剂量依赖性(图1)。

图1 PASMCs内HIF－1α蛋白表达

2.3 PASMCs内ROS含量 缺氧组细胞内ROS显著升高，与常氧组比较有统计学意义(P＜0.01)。缺氧+YFHXG组细胞内ROS显著降低，且具有剂量依赖性;缺氧+YFHXG低浓度组与缺氧组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，其他各组与缺氧组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见图2。

图2 PASMCs内ROS含量

3 讨论

HIF-1是一个由调节性HIF-α及构成性表达HIF-1β两个亚基组成的异源二聚体。HIF-1α是HIF-1的调节亚基和活性亚基，常氧条件会通过氧依赖降解结构域被降解，低氧时HIF-1α进入细胞核内与HIF-1β形成二聚体后激活靶基因的转录;是细胞为适应缺氧环境和各种病理刺激所表达的核心调控因子，可调控多种与低氧条件下细胞生存相关靶基因的转录和信号的转导，这其中就包括编码内皮素-1、血红素加氧酶-1/诱导型一氧化氮合酶、瞬时感受器电位等多种血管活性物质的基因，与低氧性肺动脉高压和肺动脉平滑肌细胞增殖关系密切[5-6]。

ROS主要由细胞内线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶介导而生成，与机体炎症和细胞内氧含量关系密切。国内外研究发现，低氧可通过催化PASMCs内NADPH氧化酶而产生ROS，ROS则可作为第二信使直接参与细胞分化、增殖及凋亡的调节，其可能是通过相关激酶的表达来调节HIF-1α的含量和活性[7-8]。另外，细胞在长期进化过程中形成了由抗氧化酶和ROS生成酶所形成的氧化还原平衡，该平衡对HIF-1通路的活性调节起着重要的作用[9]。而最新研究发现，ROS在缺氧性肺血管重建的发病机制中也发挥重要作用，它参与肺动脉平滑肌的收缩、增殖及凋亡等活性的调控。但是有关缺氧时ROS生成量的变化及其对PASMCs收缩和凋亡影响的研究结果尚存争议[10-11]。

益肺活血颗粒是我国著名中医内科学家董建华院士多年来治疗慢性阻塞性肺疾病和慢性肺心病的代表方，在补中益气汤与血府逐瘀汤基础之上辨证加减而制成，其临床疗效显著，而且前期动物研究和细胞实验也发现该药具有保护血管内皮细胞、抑制缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖、减轻血管缩窄、降低肺动脉高压的功能。在此基础上，我们猜测其可能有对抗缺氧和通过某种途径改善细胞的缺氧反应，而HIF-1α和ROS是细胞缺氧时重要的活性介质。

本研究通过分离培养大鼠PASMCs，并同时给予低氧和不同浓度的益肺活血颗粒含药血清进行干预，观察发现缺氧条件下PASMCs向合成型转化:增生肥大、胞内线粒体增多、粗面内质网扩大、高尔基复合物高度合成[12];而相比缺氧组，培养3 d后显微镜下可直接观察到缺氧+YFHXG高、中浓度组的PASMCs生长受抑制，数目减少，且舒张明显，可能与细胞内Ca2+浓度下降相关。通过免疫组化法测定细胞内HIF-1α蛋白的表达，激光共聚焦显微镜测定细胞内ROS的含量，发现与常氧组相比，缺氧组PASMCs增殖明显活跃，HIF-1α蛋白表达及ROS含量增加;与缺氧组相比，缺氧+YFHXG高、中浓度组大鼠PASMCs的生长明显受抑制，而且HIF-1α蛋白表达及ROS含量降低。

本研究结果说明了缺氧可以直接刺激PASMCs的增殖;而益肺活血颗粒可以显著抑制低氧对大鼠PASMCs的促增殖作用，其机制可能是通过抑制HIF-1α-ROS信号通路来实现，从而在改善肺血管重构、降低肺动脉高压方面有着独特的疗效，有望成为祖国医药中治疗肺动脉高压的良药，但其抑制PASMCs增殖的机制还须进一步深入探讨。

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