从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体

王欲晓，解 鹏，高荣凯，杨东玲，周丽君

生存素(survivin)是由 Ambrosini等[1]在 1997年发现的，是凋亡抑制蛋白家族成员，由142个氨基酸组成的相对分子质量为16.5×103的蛋白。研究发现:survivin主要分布于胚胎及分化未成熟的组织，在成人体内仅在胸腺、甲状腺、子宫内膜组织、生殖腺中有微量表达，在其他正常组织中均未检测到其表达，而在大部分肿瘤中则高表达尤其是肺、乳腺、脑、肠等组织中。Survivin在进化上高度保守，具有调节细胞分化和抑制凋亡的功能，是目前已知作用最强的凋亡抑制蛋白之一。Survivin对细胞凋亡的抑制及其在肿瘤细胞中表达的特异性，使得以survivin为靶点治疗恶性肿瘤的设想成为近年来研究的新热点[2-3]。

国外已开展针对该蛋白的抑制剂、反义寡核苷酸、小分子干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)的研究，以期筛选到具有应用前景的治疗药物。目前，已经有多种针对survivin靶点的药物开始进行Ⅰ期或Ⅱ期临床试验，如反义寡核苷酸LY21830B、转录抑制剂YM155等，并显示出良好治疗效果[4]。随着基因工程技术的发展，治疗性单抗已成为发展最快的生物药物，是生物制药的热点，特别是针对恶性肿瘤的治疗性抗体是开发最活跃的领域。如用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗、治疗B淋巴细胞瘤的利妥昔单抗等在临床应用中均显示了良好的效果[5]。但针对细胞内survivin蛋白的治疗性人源抗体研究鲜见报道。我们实验室在军队“十五”重点课题的资助下，构建了经重组酶系统cre-loxp定位介导的大容量天然抗体库，并从中筛选到针对不同抗原的多株人源抗体[6-7]。本研究尝试从该抗体库中筛选出人源抗survivin抗体，探讨其在今后肿瘤治疗中的应用。

1 材料与方法

1.1 大容量抗体库及主要试剂 大容量噬菌体抗体库为本中心构建，survivin由海军总医院检验科郭建巍博士赠送[8]，辅助病毒VCSM13、大肠杆菌菌株XL1-Blue为本中心保存，各种内切酶均为promega公司产品，辣根过氧化物酶-V5(horseradish perroxidase，HRP-V5)、卵清蛋白(ovalbumin，OA)和铁蛋白(ferritin，Fer)购自美国SIGMA 公司，HRP-抗M13购自美国通用电气公司，survivin兔多抗购自中杉金桥公司、HRP-羊抗兔IgG购自英国Abcam公司，抗原管(immuno-tube)购自丹麦NUNC公司。

1.2 大容量噬菌体抗体库的优化与制备 初级噬菌体抗体库以100∶1的比例复合感染(multiplicity of infection，MOI)BS1365细胞，37℃水浴保温1 h，使多副本载体进入同一个细胞，加含氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的2YT 培养液至 400 ml，Amp 终浓度为100 μg/ml。振荡培养至吸光度A600=0.5左右加5 ml辅助病毒VCSM13(滴度1.7×1012cfu/ml)，30℃培养过夜，离心回收上清，聚乙二醇8000(polyethylene glycol 8000，PEG8000)沉淀回收，测定滴度。再以MOI≤1的比例感染1 000 ml对数生长期的 XL1-Blue菌，37℃静止30 min;取少量铺含Amp的培养盘计算库容，补足 Amp，加入8 ml VCSM13，30℃过夜，次日回收上清，常规 PEG8000沉淀。1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶解[9-10]。

1.3 抗survivin噬菌体抗体的筛选 将survivin抗原用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液Buffer稀释至50 μg/ml，以1 ml包被免疫管，4℃过夜，次日用3%脱脂奶封闭2 h，加入1 ml噬菌体抗体库(约1×1013cfu/ml)，37℃孵育2 h，以含0.05%聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯(Tween)-20的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗15次(第1轮洗15次，第2～4轮洗涤20次以上)，加入1 ml新鲜XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15 min，在孵育过程中轻轻的摇动几次，使其更好地与抗体结合，提高感染的效果，转入10 ml超级营养肉汤(super broth，SB)培养液中;从回收的菌液取适量铺在含有Amp培养盘测定滴度，其余菌液37℃培养1 h，加入含有Amp培养液增至为100 ml，2～3 h后，长到对数生长期加入1 ml滴度为2.3×1012cfu/ml辅助病毒VCSM13，30℃振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体的回收率[11-12]。

1.4 噬菌体抗体的制备 从筛选第3、第4轮的培养盘随机挑取集落在含有Amp的2YT培养液中培养过夜，第2天取30 μl细菌到1 ml SB培养液中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，离心收取上清即得到噬菌体抗体。

1.5 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法鉴定噬菌体抗体 将survivin稀释至 2 μg/ml，以每孔 50 μl包被 ELISA 板，4℃过夜，弃去孔内液体，用3%脱脂奶-PBS封闭2 h后加入待检测的噬菌体抗体液，37℃孵育2 h，用0.05%Tween-20 PBS注满洗涤3次，加入二抗HRP-抗M13鼠单抗，孵育1 h，洗涤后加入邻苯二胺盐酸盐(O-phenylendiamine dihydrochloride，OPD)底物显色，读取吸光度A490值。显色阳性的克隆再以survivin、OA、Fer为抗原同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性。

1.6 可溶性抗体的的表达及检测 用阳性噬菌体抗体感染HB2151菌株后铺含Amp培养盘，第2天挑克隆，细菌在对数生长期加入异丙基-β-D-硫化半乳糖苷(1 mmol/L)28℃诱导，得到可溶性的抗体。ELISA方法同上，加入待检测的可溶性上清，以HRP-V5为二抗;阳性对照孔加入1∶500稀释的抗survivin兔多抗，二抗为1∶1 000稀释的HRP-羊抗兔IgG，分别检测上清中单链的表达与生长素的结合活性及其特异性。

2 结果

2.1 工作库制备结果 原始噬菌体抗体库通过重组酶系统cre-loxp介导的定位重组，扩增出一个新的大容量噬菌体库，获得库容为4×1010的大容量人源噬菌体抗体库，所获抗体库滴度为3×1012cfu/ml。

2.2 抗survivin噬菌体抗体的筛选结果 经过4轮的筛选，测定每轮洗脱回收的噬菌体滴度，发现有一定的富集(表1)。

表1 噬菌体抗体库的投入产出比

2.3 抗survivin噬菌体抗体结合活性 从第3、第4轮菌落中随机挑取100个克隆，制备噬菌体抗体。ELISA表明，21个能与 survivin抗原结合，随后用OA、Fer作为对照鉴定，特异性结合的克隆为10个。表2为从中选取的4个结合活性较高的阳性克隆、1个阴性克隆与各抗原反应结果。

表2 噬菌体抗体与不同抗原反应的ELISA检测

2.4 可变区基因的多样性分析(DNA指纹) 将筛选到的10个噬菌体阳性克隆进行可变区基因扩增，酶切消化得到DNA指纹图谱，10个阳性菌落系来自8种不同的scFv基因克隆，其中2、6、9为相同指纹(图1)。

图1 阳性克隆可变区基因的指纹图谱

2.5 可溶性scFv抗体的表达 将筛选出的特异性8种噬菌体克隆，制备可溶性抗体，用OA、Fer进行特异性鉴定，其中5个克隆经ELISA检测具有较高的特异结合活性。

表3 可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测

3 讨论

噬菌体抗体库技术出现于20世纪90年代初期，是将全套人的抗体基因克隆到噬菌体载体中，利用其呈现在噬菌体表面的特点，经过几轮“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，除可以方便地用不同抗原筛选出相应的人源抗体外，还可以同时获得针对同一抗原的不同基因型的多株抗体，显示了其良好的应用前景[13-14]。

细胞内抗体可在细胞内表达或直接进入细胞，与特定的靶分子作用(干扰或阻断靶分子的加工、分泌或功能)从而发挥其生物学功能的抗体[15]。随着分子生物学技术的发展，越来越多具有重要作用的细胞内功能蛋白质被发现。细胞内抗体一方面可作为一种外源性重组抗体，特异性地作用于细胞内抗原，作为表型基因敲除的研究工具;另一方面，如果将抗体的结构域与适当的定位信号融合组装，即可将其定位在细胞内靶抗原的相应位置，达到抑制靶蛋白功能。肿瘤基因治疗也是细胞内抗体技术应用的一个重要领域，这方面的研究主要集中在肿瘤细胞高表达的某些蛋白及与肿瘤细胞耐药、侵袭和转移相关的蛋白上。如酪氨酸激酶家族成员erbB-2在调节细胞生长和分化中起重要作用，抗erbB-2细胞内抗体用于卵巢癌患者治疗已进入Ⅰ期临床。又如Cyclin E是调节正常细胞分裂的一种重要的细胞周期蛋白，在乳腺癌中高表达，细胞内表达的抗Cyclin E抗体可抑制乳腺癌细胞的生长[16-17]。

单链抗体是由可变区域重链VH和可变区域轻链VL中间加一段linker构成，与完整抗体及抗体的Fab段相比具有相对分子质量小、免疫原性低、穿透力强等优点，一般用其作为细胞内抗体[18]，有利于作为“导向载体”等应用于人体。本研究中，我们利用人源大容量噬菌体抗体库筛选到多株针对survivin特异性结合的人源抗体。由于survivin蛋白存在于细胞内，下一步我们将对获得抗体进行生物功能的测定，以期获得具有临床应用前景的人源抗survivin抗体。

[1]Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3(8):917-921.

[2]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10):1346-1353.

[3]Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural，functional and therapeutic biology of survivin[J].Cancer Lett，2006，244(2):164-171.

[4]Altieri DC.Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer，2008，8(1):61-70.

[5]Nelson AL，Dhimolea E，Reichert JM.Development trends for human monoclonal antibody therapeutics[J].Nat Rev Drug Discov，2010，9(10):767-774.

[6]王欲晓，贾培媛，王玉霞，等.人源抗棱曼过渡态类似物(P6)的抗体筛选[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26(3):250-252.

[7]Du L，Zhou LJ，PAN XJ，et al.Radiosensitization and growth inhibition of cancer cells mediated by an scFv antibody gene against DNA-PKcs in vitro and in vivo[J].Radiat Oncol，2010，5:70.

[8]郭建巍，王小平，马骢，等.Survivin蛋白的原核表达及在肿瘤诊断中的初步应用研究[J].中国实验诊断学，2007，11(12):1576-1581.

[9]乔媛媛，王琰，陈晓穗，等.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(3):194-197.

[10]Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries[J].Nat Biotechnol，2000，18(1):75-80.

[11]王琰，刘群英，化冰，等.从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆[J].中国免疫学杂志，1998，14(2):115-118.

[12]Qiao Y，Zhou L，Wang Y，et al.Screening for antibodies against intact cancer cells with a naive large phage antibody library[J].Int J Mol Med，2012，29(1):37-46.

[13]Griffiths AD，Willisms SC，Hartley O，et al.Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires[J].EMBO J，1994，13(14):3245-3260.

[14]Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries[J].Nat Biotechnol，2000，18(1):75-80.

[15]Wheeler YY，Chen SY，Sane DC.Intrabody and intrakine strategies for molecular therapy[J].Mol Ther，2003，8(3):355-366.

[16]Alvarez RD，Barnes MN，Gomez-Navarro J，et al.A cancer gene therapy approach utilizing an anti-erbB-2 singlechain antibody-encoding adenovirud(AD21):a phaseⅠtrial[J].Clin Cancer Res，2000，6(8):3081-3087.

[17]Strube RW，Chen SY.Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells:enhanced intracellular stability of novel sFv-Fc intrabodies[J].J Immunol Methods，2002，263(1/2):149-167.

[18]Beckman RA，Weiner LM，Davis HM.Antibody constructs in cancer therapy:protein engineering stragies to improve exposure in solid tumors[J].Cancer，2007，109(2):170-179.