超速起搏预适应的延迟保护作用与环氧化酶2表达的关系

徐玲 陈国桢

缺血性心脏病是严重危及人类健康的疾病之一，其发病机制及防治措施的研究一直是医学领域的热点，在研究过程中，人们逐渐认识到激发和扶持机体内源性抗损伤能力是细胞保护的最有效措施，并成为当前细胞保护机制的重要内容。Murry等［1］于1986年从犬的实验中首先提出了缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)的概念，目前大量研

究显示，心肌IPC的延迟保护作用主要与炎症时产生的介质及新生蛋白质的合成有关［2］。环氧化酶2(COX-2)mRNA在正常心脏上几乎检测不到［3］，但发现COX-2基因敲除的小鼠心肌发生了明显的纤维化［4］，提示COX-2可能具有维持正常心肌功能的作用。放线菌素D又称更生霉素，可阻碍COX-2的生成。预适应的诱导方法具有多样性，一次或多次短暂缺血再灌注是启动预适应的经典方法。本实验采用快速起搏右心室的方法，同时检测COX-2的表达情况，从而探讨预适应延迟保护作用和COX-2的关系，为临床治疗缺血性心肌病和保护心肌提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康的新西兰雄兔24只，由上海动物实验中心提供［动物合格证号:0013964，许可证号:SCXK(沪)2002-0011］，体质量 2.2 ～2.8 kg，平均(2.5±0.2)kg。

1.1.2 仪器 心电监护仪(Hewlett-Packard GmbH，德国)，5F双极临时起搏电极(美国St.Jude Medical Inc)，DF-5A心脏电生理刺激仪(苏州工业园区东方电子仪器厂)，XD-7300心电图机(上海医疗器械技术公司)，小动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂)，放线菌素D(浙江海正药业股份有限公司)，山羊抗兔、大鼠、小鼠等COX-2的多克隆抗体(北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 新西兰雄兔24只，随机分成3组:(1)单纯结扎组:经耳缘静脉穿刺静脉留置针，建立静脉通道，并用稀释的肝素(1∶100 U)冲管，用2%戊巴比妥钠按30 mg/kg缓慢静脉注入，麻醉后观察兔的呼吸、心率以及对刺激的反应，待麻醉完全后，四肢备皮，接心电监护仪和心电图机，颈部备皮，消毒铺巾，颈部皮肤正中切开，分离右侧颈静脉并插A鞘管，5F起搏电极经动脉鞘管插入，送入右心室，高于基础心率20次/min起搏10 s，描记起搏时体表心电图，证实已经到达心室70 min后取出置管。结扎右颈静脉，80万U青霉素钠局部预防抗感染，缝合皮肤后放回动物室继续饲养。(2)起搏组:同单纯结扎组置管后，以500次/min起搏右心室10 min×4次(间歇5 min)，此后同单纯结扎组。(3)起搏+放线菌素D组:动物麻醉后静脉注射放线菌素D 0.1 mg/kg，起搏电极经动脉鞘管插入，送入右心室起搏完毕后，余同起搏组。

1.2.2 模型建立 24 h后各组重新麻醉，胸前区备皮，颈内静脉注射500 U/kg肝素抗凝。四肢接心电监护仪和心电图机，颈部消毒铺巾，剪开颈部缝线，分离右侧颈静脉，并颈总静脉插管送入右心室，以备采血。气管切开，插管，接小动物呼吸机，调节呼吸参数:呼吸比1∶1，呼吸频率40次/min，潮气量按10 ml/kg计算。胸前区消毒铺巾，沿胸骨左缘2、3、4肋剪开胸骨表面皮肤，剪断胸骨左缘2、3、4肋，尽量不损伤胸膜，剪开心包，暴露心脏，在冠状动脉前降支中上1/3处，用4.0丝线穿过浅层心肌，其末端套一外径为2 mm的聚氯乙烯管，通过拉紧丝线阻断冠状动脉血流，用动脉夹挤压聚乙烯管，此时心脏表面出现青紫，造成心肌缺血(ST段明显抬高，缺血区域心肌颜色变为灰暗表示有效)，松开丝线即可恢复灌流，穿线结扎20 min，松线后再灌注60 min，再灌注30 min时观察有无心律失常，若无心律失常，用临时起搏电极于心室表面刺激10 s，观察有无诱发心律失常，再灌注60 min时同前操作诱发心律失常，并连续记录心律失常情况。

1.2.3 标本采集 (1)分别于结扎前10 min，结扎后20 min、再灌注30 min、再灌注60 min时取血，以检查肌酸激酶(CK)和CK同工酶(CK-MB)，于离心机3000转/min离心2次，取上清液置于－80℃中保存待测。(2)再灌注60 min后立即处死新西兰兔，取出左心室缺血区和结扎线上的心肌组织各一块，约5 mm×5 mm×5 mm大小，10%中性甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋。所有切片均随机盲法下读片，并由我院病理科相关专业人员复核并确认结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3组CK、CK-MB水平比较

3组实验兔冠状动脉缺血前的血清CK和CK-MB差异无统计学意义(均为P＞0.05);缺血后再灌注0 min、30 min、60 min的血清 CK和 CK-MB水平明显较缺血前升高，且随时间变化有逐渐升高的趋势，单纯结扎组升高最为明显，起搏组上升最小，起搏+放线菌素D组介于二者中间，见表1。

表1 各组实验兔缺血再灌注前后血清CK和CK-MB的变化(，IU/L)

表1 各组实验兔缺血再灌注前后血清CK和CK-MB的变化(，IU/L)

注:缺血后3组比较，均为P＜0.01

组别 只数CK CK-MB单纯结扎8缺血前 900±319 120± 55再灌注0 min 2625±423 1332±178再灌注30 min 3202±712 1535±142再灌注60 min 3723±735 1709±163起搏 8缺血前 800±266 121± 48再灌注0 min 1492±474 614±182再灌注30 min 1760±458 756±114再灌注60 min 2163±602 904±149起搏+放线菌素D 8缺血前 839±179 114± 38再灌注0 min 2071±390 1095±183再灌注30 min 2521±423 1208±193再灌注60 min 2896±430 1376±274

2.2 心律失常的诱发情况

单纯结扎组和起搏+放线菌素D组的实验兔在缺血再灌注后自发或经刺激后诱发出现恶性心律失常，包括频发期前收缩、室性心动过速、房室传导阻滞、心室颤动等，体表心电图如图1～3所示。单纯结扎组再灌注过程中发生心律失常的实验兔共有5只，起搏+放线菌素D组有4只，起搏组无心律失常发生。三者之间比较差异具有统计学意义(P=0.027)，起搏组与单纯结扎组比较差异具有统计学意义(P=0.026)，由此可知快速起搏干预后有减少心律失常发生的趋势，起搏+放线菌素D组与单纯结扎组比较差异无统计学意义。

2.3 COX-2的表达情况

图4A取自起搏组左心室结扎线上、下的心肌组织，心肌细胞胞浆和胞核均染成棕褐色，染色深;图4B取自起搏+放线菌素D组左心室结扎线上、下的心肌组织，心肌细胞胞浆和胞核部分染成浅黄色;图4C取自单纯结扎组左心室结扎线上、下的心肌组织，心肌细胞胞浆和胞核无明显染色。

各组结扎线上和结扎线下COX-2的阳性表达情况见表2，结果分为4个层次:0～1分为“－”，2～3分为“+”，4～6分为“++”，7～9分为“+++”。部位表达广泛，结扎线上、下的心肌均有表达，3组实验兔结扎线上和结扎线下阳性表达程度秩和检验差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 3组实验兔心肌组织结扎线上、下COX-2表达阳性染色水平的比较

3 讨论

缺血心肌保护一直是心血管领域的研究热点，80年代以来，心肌保护的研究重点转向细胞保护，即增强心肌细胞对缺血缺氧等损伤的抵抗力。自从1986年Murry等首先提出IPC的概念后，近年来对其机制进行了深入的研究。对预适应模型的建立也进行了广泛的探讨。预适应方法有很多种，各具有一定优点和局限性，人们一直在探索更有临床实用价值的预适应方法。Vegh等［5］1991年提出超速起搏预适应概念，即通过快速起搏造成心肌短暂的供血减少，同时增加氧耗，使心脏发生相对缺血，进而对后续的长期缺血产生保护。该方法消除了IPC本身短暂缺血的致心律失常作用，常用于研究预适应对心律失常的保护作用，但对于如何具体建立超速起搏的模型，目前尚未统一。

本实验中，兔经开胸暴露心脏，通过拉紧丝线以阻断冠状动脉血流，心肌表面随即变成青紫色，缺血后体表心电图ST段呈弓背向上抬高的动态改变，松线后心肌表面又恢复红润。提示穿线结扎冠状动脉缺血再灌注模型建立成功。

心肌缺血时能量代谢发生障碍，乳酸、脂肪酸、脂酰辅酶A等酸性代谢产物蓄积，持久的心肌缺血可发生不可逆性损伤，大分子的酶释放入血，如血中CK和CK-MB升高。由于CK和CK-MB检测方便、快捷、价格低廉，许多实验都以CK和CK-MB作为心肌损伤严重程度的评价指标，可大致反映心肌受损的程度。本实验采用经典的缺血再灌注模型的建立方法，开胸结扎冠状动脉，结扎前10 min，3组兔的CK和CK-MB处于同一水平，3组之间相互比较差异无统计学意义，由此可知，3组兔24 h前经过不同的干预因素如超速起搏和放线菌素D，对其心肌损伤无明显影响，而缺血后CK和CK-MB较缺血前有显著的上升，提示随时间变化逐渐上升的趋势，符合心肌急性缺血的改变，伴再灌注心律失常出现，反过来又支持了缺血再灌注模型建立成功。本实验在设计过程中也存在不足之处，如未采用反映心肌损伤更为直观的电镜检查和采用灵敏度较高的肌钙蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)检测，有待今后进一步改进并行深入的研究。

预适应的保护作用主要涉及以下3个方面:减轻心肌坏死、减少恶性心律失常的发生及促进心肌功能恢复。(1)减轻心肌坏死:目前已证实，IPC可以减少细胞损伤，缩小心肌梗死面积，这一强大作用是目前任何药物所无法比拟的。(2)减少恶性心律失常的发生:1987 年，Shiki和 Hearse［6］首次报道IPC降低大鼠缺血后恶性心律失常的发生，随后Wu等［7］通过临床研究进一步表明，IPC可以明显减少冠状动脉多支病变经冠状动脉旁路移植术后室性心动过速和心室颤动的发生率。国内学者吴棘等［8］用快速起搏心房也能明显降低缺血再灌注后心律失常的发生率和致死率。(3)改善心肌功能:IPC可以明显改善缺血再灌后心肌收缩及舒张功能，提高左心室收缩功能，增强心肌的收缩力。本实验通过快速起搏法研究预适应现象的保护作用，观察到起搏组再灌注不同时相CK和CK-MB的升高都明显低于单纯结扎组，恶性心律失常的发生率也低于对照组，而CK和CK-MB是心肌损伤或坏死时释放入血，由此可知超速起搏兔右心室后，兔心肌产生对缺血再灌注损伤的耐受，使心肌损伤减少，频发室性期前收缩、室性心动过速和心室颤动等恶性心律失常也明显减少。由于心律失常的发生与缺血再灌注引起的心肌胞质Ca2+超载有关，故吴棘等［8］推测超速起搏预适应的抗心律失常作用可能是通过减少心肌损伤，减轻了细胞质膜的功能障碍，进而减轻了胞质内Ca2+超载而实现的。最近有报道，预适应的抗心律失常由缓激肽(bradykinin)介导，通过激发ATP敏感性K通道，发挥抗心律失常作用［9］，但缓激肽、ATP敏感性K通道和效应蛋白等联系起来，值得进一步探讨，所以快速起搏预适应方法可以模拟经典的缺血预适应现象，本实验观察到了三大保护作用中的前面两大方面，由于条件有限未能监测血流动力学方面的变化，是本实验的不足之处。

免疫印迹分析显示，缺氧时(1%O2)人脐静脉内皮细胞COX-2蛋白增加4倍以上，Northern blot和RT2PCR均显示，COX-2mRNA水平相应增加［10］。在兔实验中发现，COX-2介导了缺血预处理的延迟性心肌保护作用［11］。缺氧在不依赖于其他刺激物的情况下可使培养的人内皮细胞COX-2基因表达增加。心肌短暂缺血时，可引发大量的血管活性物质从冠状动脉内皮细胞和(或)心肌细胞释放，其中缓激肽被认为是参与IPC心肌保护作用的主要活性物质。研究报道，在长时间缺血后的再灌注早期给予外源性缓激肽，可缩小心肌梗死面积［12］。有研究证实整体给药24 h后，在大鼠离体心脏缺血缺氧复灌模型上，缓激肽能诱发24 h后的心脏晚期保护效应［13］。COX-2的抑制剂可消除缓激肽预处理的晚期心肌保护作用，提示COX-2可能作为缓激肽的下游参与其诱导的晚期心肌保护作用。在体内花生四烯酸代谢过程中最主要的限速酶COX-2被证实是一种诱导型酶，其表达受多种刺激因素，如细胞因子、生长因子、佛波酯等所诱导。Bolli等［14］在兔的缺血再灌注损伤模型中发现，缺血后24 h即有COX-2蛋白及其代谢产物增加，认为COX-2表达及活性上调，对于预适应晚期的心肌顿抑和心肌梗死具有保护作用，而COX-2抑制剂可使这种保护作用完全丧失。

因此，我们可以推断COX-2是心肌缺血预处理的保护性蛋白，当然不排除心肌受其他刺激也可增加COX-2的表达。但这些都有待进一步证实。

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