阿魏酸川芎嗪后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

赵润英，郝伟，孟祥军，李昭，赵丽妮，马明洋，丁双双

（1.沈阳医学院药理教研室，机能实验中心，药物研究中心，沈阳 1 1 0 0 3 4；2.中国医科大学9 7期临床医学专业，沈阳 1 1 0 0 0 1；3.沈阳博润生物技术有限公司，沈阳 1 1 0 1 6 8）

冠状动脉再通术是目前治疗急性心肌梗死的重要手段，而缺血再灌注损伤却成为阻碍缺血心肌从再灌注策略中获得最佳疗效的临床难题，引起了人们极大的关注［1］。阿魏酸川芎嗪（ligustrazine ferulate，LF）是以阿魏酸和川芎嗪（ligustrazine，LZ）结构为基础合成的阿魏酸盐类化合物。有研究显示，LF在抗血小板聚集方面表现出较好的药理活性，且作用强于LZ，但其对心肌缺血再灌注损伤的作用鲜有报道。本研究旨在探讨LF后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康雄性SD大鼠50只，体质量250~300 g，中国医科大学实验动物部提供。

1.1.2 仪器：BL-420F生物机能实验系统和HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；MiVnt图像分析系统（上海光学仪器研究所）；7180全自动生化分析仪（日本HITACHI公司）。

1.1.3 药品与试剂：盐酸LZ注射液（20 mg/mL，安徽省立药业有限公司）；LF注射液（20 mg/mL，沈阳医学院药物研究中心）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测测试盒、伊文氏蓝和TTC染液（南京建成生物工程研究所）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（瑞士Roche公司）；Fas检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与心肌缺血再灌注模型的建立：48只雄性SD大鼠随机分成假手术组（SM组）、缺血再灌注组（I/R组）、LZ组和LF组。采用结扎左冠状动脉前降支30 min、再灌注120 min的方法，复制心肌缺血再灌注模型：大鼠20%氨基甲酸乙酯0.7 g/kg腹腔注射麻醉；四肢皮下插入针形电极、右颈动脉插管至左室，连接BL-420 F生物机能实验系统，分别记录Ⅱ导联心电图和血流动力学参数；右颈静脉置管用于输液给药；气管插管，接呼吸机；距胸骨左缘0.5 cm处，剪断第3、4肋骨，打开胸腔，以左心耳与肺动脉圆锥之间的左冠状静脉作为结扎标志血管，用3/8弧4×12圆针穿4/0缝线（预先将一个带凹槽的聚乙烯环穿在缝线上），在左心耳根部下方2 mm处，以深1.5~2 mm、宽2~3 mm穿过心肌表层，缝线两端在聚乙烯环的凹槽处结扎左冠状动脉前降支（以心电图显示ST段抬高为结扎成功标志）30 min；在聚乙烯环凹槽处剪断结扎线，再灌注120 min（以抬高的ST段回落50%为再灌注成功标志）。SM组只穿线不结扎，LZ、LF组于再灌注前10 min颈静脉注射 LZ、LF 40 mg/kg。

1.2.2 效应指标检测

1.2.2.1 血流动力学指标 冠脉下穿好结扎线后，各组于缺血前（时点 1）、缺血 30 min（时点 2）、再灌注 120 min（时点 3）记录心率（heart rate，HR）、左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室收缩末压（left ventricular end systolic pressure，LVESP）和心室最大压力上升和下降速率（±dp/dtmax）等参数。

1.2.2.2 氧化应激相关指标 再灌注结束后右颈动脉采血2 mL，静置后3 000 r/min离心10 min，检测血清中MDA的含量、SOD的活性。

1.2.2.3 心肌梗死范围 右颈动脉采血后经颈静脉注入5%伊文氏蓝1.5 mL，待大鼠口唇蓝染后取出心脏。将左室标本置于-20℃冰箱冻存20 min后取出，自心尖向心底平行房室沟方向切出相等厚度的5片心肌片；将切片置预温37℃、1%TTC磷酸缓冲液中染色30 min后，再置于10%中性甲醛液中固定24 h；肉眼可见非缺血区为蓝色、缺血非梗死区为砖红色、缺血梗死区为苍白色。计算心肌缺血范围和心肌梗死范围，心肌缺血范围=缺血区面积（area at risk，AAR）/左室面积（1eft ventricle，LV）×100%，心肌梗死范围=梗死区面积（infarct size，IS）/AAR×100%。

1.2.2.4 心肌细胞凋亡指数与凋亡相关基因表达将左室于4%甲醛（pH7.4）中固定48 h（4℃）后置于75%乙醇中，然后常规石蜡包埋，于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1 mm连续切取5张3~4 μm厚的切片，烤干备用。TUNEL法检测凋亡心肌细胞。在光学显微镜下，凋亡细胞核呈棕色，正常细胞呈蓝色。每张玻片随机选择6个高倍镜（40×）视野，然后计算心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI），AI=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%。免疫组化法检测心肌组织Fas蛋白阳性细胞。在光学显微镜下，细胞核染成棕色为阳性细胞。计数6个高倍镜（40×）视野Fas阳性细胞数，计算平均阳性细胞表达指数（positive express index，PEI），PEI=阳性细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，3组及3组以上组间差异采用方差分析，差异有统计学意义时再用Dunnett法进行多个样本均数的两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LF后处理对大鼠血流动力学的影响

缺血前各组血流动力学参数比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与 SM 组比较，I/R、LZ、LF 组 HR、LVESP、±dp/dtmax等指标均降低，LVEDP均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组比较，LZ、LF能加快HR、升高LVESP和±dp/dtmax、降低LVEDP，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 LF后处理对大鼠氧化应激相关指标的影响

血清生化指标检测结果显示：与SM组比较，I/R组血清MDA含量明显提高，SOD活性明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；LZ、LF能明显降低血清MDA含量、提高SOD的活性，与I/R组比较差异有统计学意义（P<0.01），但LZ、LF组尚未达到SM组的水平，与之比较差异仍有统计学意义（P<0.01）。见表2。

表1 L F对大鼠血流动力学的影响T a b.1 T h e e f f e c t s o f L Fp o s t c o n d i t i o n i n g o n t h e p a r a me t e r s o f h a e mo d y n a mi c s i n r a t s

2.3 LF后处理对大鼠心肌梗死范围的影响

伊文氏蓝和TTC双重染色后检测心肌梗死范围结果显示：SM组未见缺血区；除SM组以外，其余各组大鼠的心肌缺血面积无明显差异（P>0.05）；LZ、LF能明显缩小大鼠心肌梗死范围，与I/R组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.4 LF后处理对大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白Fas表达的影响

TUNEL法检测心肌细胞凋亡与免疫组化法检测凋亡相关蛋白Fas表达的结果显示：SM组凋亡心肌细胞及Fas蛋白阳性细胞极少；与SM组比较，I/R、LZ、LF各组大鼠凋亡心肌细胞及Fas蛋白阳性细胞明显增多，差异均有统计学意义（P<0.01）。与I/R组比较，LZ、LF能明显抑制心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白Fas的表达，降低心肌细胞AI和Fas蛋白的PEI，差异有统计学意义（P<0.01）。除血流动力学指标外，LF对大鼠氧化应激相关指标、心肌梗死范围、心肌细胞AI和Fas蛋白表达的影响等作用均强于LZ，LF组与LZ组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是溶栓、经皮冠状动脉腔内血管成形术或动脉搭桥等冠状动脉再通术术后的重要并发症，临床表现为心脏舒缩功能障碍，如心肌顿抑、心律失常、心力衰竭等［2］。LVESP、LVEDP、±dp/dtmax是评价心肌收缩功能常用的指标，LVESP和+dp/dtmax降低反映左室收缩功能下降，LVEDP升高和-dp/dtmax下降反映左室舒张功能降低。本研究所测血流动力学指标结果显示，LF使 HR、LVESP、±dp/dtmax升高，而LVEDP降低，说明LF后处理能提高缺血再灌注大鼠的心肌收缩力，增加心室顺应性，改善心脏功能。心肌缺血再灌注损伤的发生机制至今尚未完全阐明，目前认为与氧自由基损伤、钙超载、能量代谢障碍、血管内皮细胞损伤、细胞凋亡和中性粒细胞浸润等因素有关［3］，其中大量氧自由基的产生是导致心肌损伤最主要的原因。心肌缺血再灌注时，氧自由基通过多种途径生成增加，它与脂质发生过氧化反应形成脂质过氧化物，引起心肌细胞氧化应激损伤。SOD是清除氧自由基所必需的酶，能保护心肌细胞免受损伤，其血清活性的高低反映了缺血再灌注心肌抗氧化的能力。MDA是氧自由基攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应的产物，其血清水平的高低反映了机体受自由基攻击的严重程度。本研究显示，LF后处理能明显提高血清SOD的活性并降低MDA水平，表明外源性LF药物后处理可提高机体的抗氧化能力。因此，抑制自由基生成或清除氧自由基可能是LF对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制之一。而氧自由基在引起心肌细胞氧化应激损伤的同时，还会诱导心肌细胞凋亡。细胞凋亡的途径主要有两条，一是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase，二是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡［4~6］。细胞凋亡是受基因调控的精确过程，涉及 ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas、c-myc、p53、ATM等蛋白。Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡［7~9］。因此，抑制Fas蛋白的表达进而抑制细胞凋亡可能是LF对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的另一机制。

阿魏酸和LZ是活血化瘀中药川芎、当归的有效成分，临床广泛应用于缺血性心脑血管疾病的治疗，现已人工合成。二者对心肌缺血再灌注损伤均具有保护作用，并在配伍应用中表现出明显的协同效果［10］。本研究对以阿魏酸和LZ结构为基础合成的LF，进行了抗缺血再灌注损伤作用与机制研究，结果显示：LF后处理能够提高抗氧化酶的活性，清除氧自由基，在抑制脂质过氧化反应，减少心肌细胞氧化应激损伤的同时，还能通过下调凋亡相关基因Fas蛋白的表达，抑制心肌细胞凋亡，从而对心肌缺血再灌注损伤产生良好的保护作用。

［1］Van Domhurg RT，Sonnenschein K，Nieuwlaat R，et a1.Sustained benefit 20 years after reperfusion therapy in acute myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2005，46（1）：15-20.

［2］Lepran I，Pollesello P，Vajda S，et a1.Preconditioning effects of levosimendanina rabbit camiac ischemia-reperfusion model［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2006，48（4）：148-152.

［3］Hoffman JW Jr，Gilbert TB，Poston RS，et a1.Myocardial repefusion injury：etiology，mechanisms，and therapies［J］.J Extra Corpor Technol，2004，36（4）：39l-411.

［4］张艳芳，范文艳，杨瑞，等.大鼠缺血再灌注心肌细胞中Caspase-3和 Bcl-2 基因的表达［J］.新乡医学院学报，2009，26（5）：441-444.

［5］曹霞，卢秀花，崔新明，等.心肌缺血再灌注损伤中细胞凋亡及其信号转导通路的研究进展［J］.吉林大学学报（医学版），2009，35（5）：964-966.

［6］Lundberg KC，Szweda LI.Initiation of mitochondrial-mediated apoptosis during cardiac reperfusion［J］.Arch Biochem Biophys，2004，432（1）：50-57.

［7］赵丽红，赵立勤，于艳华，等.清开灵注射液对心肌缺血-再灌注损伤大鼠凋亡相关蛋白Caspase表达的影响［J］.中国实验诊断学，2012，16（7）：1171-1173.

［8］郭佳，肖传实，白瑞，等.脂联素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响［J］.中国药理学通报，2012，28（7）：930-933.

［9］纪勇，陈国强，黄斌，等.Caspase抑制剂对大鼠心肌缺血/再灌注损伤 Fas/FasL 表达的影响［J］.中国微循环，2009，13（2）：102-104.

［10］杨家荣，张密霞，常亮堂，等.川芎嗪、阿魏酸及其配伍对心肌缺血再灌注模型大鼠的保护作用及对黏附分子的影响［J］.中草药，2008，39（7）：1054-1056.