扩张型心肌病心肌Fas蛋白表达

魏淑荣，陈新山，陈煌峰，3，孙许朋，4，黄光照

（1.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北 武汉 430030；2.益阳市公安局刑侦支队，湖南 益阳 413000；3.武汉市公安局刑事侦查局，湖北 武汉 430019；4.新乡医学院法医学教研室，河南 新乡 453003）

扩张型心肌病心肌Fas蛋白表达

魏淑荣1，2，陈新山1，陈煌峰1，3，孙许朋1，4，黄光照1

（1.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北 武汉 430030；2.益阳市公安局刑侦支队，湖南 益阳 413000；3.武汉市公安局刑事侦查局，湖北 武汉 430019；4.新乡医学院法医学教研室，河南 新乡 453003）

目的 探讨扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）心肌Fas蛋白的表达情况及其与DCM猝死的关系。 方法 用免疫组织化学法和图像分析技术定量检测本教研室1997—2007年间9例DCM猝死和11例暴力死或其他死者的心肌Fas蛋白表达情况。 结果 DCM猝死组心肌Fas蛋白表达明显增多，阳性着色在心肌纵切面细胞膜上及胞浆内呈棕黄色颗粒状或条状分布，横断面细胞膜见环形棕黄色颗粒带；对照组未见明显变化或仅见小面积浅淡着色。定量检测结果显示其表达面积在两组间的差异有统计学意义（P=0.002），表达的平均光密度差异无统计学意义（P=0.675）。 结论 DCM猝死者心肌Fas蛋白表达明显增多，可能与DCM患者发生的因心律失常和心功能衰竭所致猝死有关。

法医病理学；心肌病，扩张型；免疫组织化学；Fas蛋白

扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是心血管系统疾病中对人类生命健康危害性较大的疾病之一。其确切的病因、发病机制仍不十分清楚。近年来，不少学者从蛋白水平、基因遗传和基因突变等方面探讨其发病原因及发病机制，以寻求新的诊断、治疗和预防方法[1-2]。有研究[3-4]表明，许多心血管疾病与心肌细胞凋亡有关，而凋亡蛋白Fas表达的改变与DCM的发生有密切联系。为此，本研究应用免疫组织化学SABC法和图像分析技术对9例DCM猝死者及11例对照组的心肌Fas蛋白表达情况进行研究，以期为进一步探讨DCM的病因、发病机制和猝死机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例及分组

从华中科技大学同济医学院法医学系1997—2007年共11年间的法医病理学尸检档案中挑选DCM猝死的心脏标本共9例，为DCM猝死组。其中，男性8例、女性1例；年龄为9岁的未成年人1例，8例成年人年龄22～46岁（平均35.1岁）。从死亡到尸检时间为7～24h。另选同期且年龄相近的暴力死和非心肌病死者11例为对照组。其中男性9例、女性2例；未成年人3例，年龄分别为11、15、17岁，8例成年人年龄20～39岁（平均28.1岁）。从死亡到尸检时间为8～25h。死因为中毒4例、电击死2例、机械性窒息和颅脑外伤各1例，其他疾病猝死3例。

DCM猝死组的病例选择标准：（1）按1996年世界卫生组织/国际心脏病学会（WHO/ISFC）公布的关于心肌病的诊断标准分类；（2）有不同程度的DCM病变；（3）从发病至死亡的时间lt;24 h；（4）经过全面系统尸解和病理切片检查，部分病例还进行毒物化验，排除机械性损伤、机械性窒息、中毒及其他自然疾病猝死。

1.2 心脏检查、取材及制片

每例心脏进行常规病理学检查，包括心脏的质量、大小、形状、左右心室和室间隔厚度等。在左心室前壁和右心室共取材3份，一份做常规石蜡切片、HE染色，一份做免疫组织化学染色，另一份备用。

1.3 主要仪器

石蜡切片机（美国AO公司），光学显微镜（日本Olympus公司），普通冰箱，PYX-DHS-35X40隔水式电热恒温培养箱，HMIAS-2000型全自动彩色图文报告分析系统（本院病理学教研室提供）。

1.4 主要试剂及其配制

一抗：兔抗人Fas多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。试剂盒：免疫组织化学SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。显色剂：3，3-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂试剂盒，内含DAB（A液）、H2O2（B液）和Tris（C液）的浓缩液各3mL；供免疫组织化学染色的载玻片预先经多聚赖氨酸处理，由武汉博士德生物工程有限公司提供。

试剂配制：（1）0.1mol/L pH=7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（Na2HPO4·12H2O 7.164 g，加蒸馏水至1 000 mL）81 mL和 0.2 mol/L NaH2PO4溶液（NaH2PO4·2H2O 3.121 g，加蒸馏水至1 000 mL）19 mL，加蒸馏水至2000mL，室温保存备用。（2）0.3%H2O2甲醇溶液：将甲醇100 mL与1 mL的30%H2O2充分混匀，放置备用。（3）粘片剂的配制：现用现配，重铬酸钾溶液处理过的干净载玻片放入以1∶50丙酮稀释的APES中，停留20～30s，取出后略干燥片刻，再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES，置通风橱中晾干，保存备用。（4）显色剂的配制：使用前将试剂盒中提供的A、B、C 3种试剂各1滴加至1mL双蒸水中，即可获得1mL DAB工作液。

1.5 免疫组织化学染色方法及步骤

免疫组织化学染色采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶法（strept avidin biotin complex，SABC）。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。染色过程中用PBS缓冲液取代一抗作为空白对照。结果判断：棕黄色颗粒为Fas表达阳性，Mayer’s苏木素复染细胞核为淡蓝色。

1.6 图像分析及统计处理

用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统，对Fas免疫组织化学染色切片进行定性和定量检测Fas蛋白表达情况。每张切片镜下放大200倍，随机取3～5个视野，测量各组Fas蛋白阳性反应面积和平均光密度。图像摄入：在200倍光镜下分别随机取3～5个视野，将图像存入计算机。图像测量：每张图像测量Fas蛋白表达的面积和平均光密度。将所测数据用±s表示，用SPSS 14.0统计软件包进行数据分析处理，统计方法为t检验。检验水准α＝0.05。

2 结 果

2.1 一般病理学变化

DCM猝死组的9例主要表现为心脏增大、心尖部变钝圆，左、右心室腔扩张，尤以左侧为重（有3例4个腔室均扩张）。1例9岁的未成年人心脏质量123g，8例成年人为330～570g（平均469.5g）。左心室壁厚度为0.8～1.6 cm（平均1.21 cm），室间隔厚度为0.8～1.4cm（平均1.14cm）。镜下见部分心肌细胞肥大，核大浓染、形状各异；多数病例的心肌间质纤维结缔组织增多，3例有明显的间质性心肌纤维化，1例心肌间质有淋巴细胞浸润，伴有脂肪组织浸润3例、心内膜纤维组织增生3例。

11例对照组中，3例未成年人心脏质量分别为125、182和243g，8例成年人心脏质量230～330g（平均290 g），左心室壁厚度1.0～1.4 cm（平均1.19 cm），室间隔厚度为0.7～1.2 cm（平均1.02 cm），除间质性心肌炎的心脏有相应的病变外，未见心脏其他明显病变。

2.2 心肌Fas蛋白免疫组织化学染色结果

DCM猝死组经免疫组织化学染色的心肌Fas蛋白表达明显增多，阳性着色，在心肌纵切面细胞膜上及胞浆内呈棕黄色颗粒状或条状分布，在横断面细胞膜见环形棕黄色颗粒条带，部分弱阳性着色心肌的棕黄色颗粒较少、着色略浅（图1）。对照组未见明显变化或仅在着色深浅程度和表达面积上有轻度变化（图2）。

图1 DCM猝死组左心室心肌Fas蛋白表达增多，胞浆内可见较多棕黄色颗粒 SABC×400

图2 对照组左心室心肌内未见Fas蛋白表达SABC×400

2.3 图像分析检测结果

心肌Fas蛋白表达面积在DCM猝死组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）；心肌Fas蛋白表达的平均光密度在两组间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 两组心肌Fas蛋白表达的面积和平均光密度的定量检测结果 （±s）

表1 两组心肌Fas蛋白表达的面积和平均光密度的定量检测结果 （±s）

注：1）与对照组相比，P＜0.05

组别 平均光密度DCM猝死 0.0289±0.0691对照 0.0898±0.0209 n91 1面积0.2589±0.07681）0.0792±0.0391

3 讨 论

3.1 Fas蛋白的生物学特性

1989年，日、美两个科研小组先后从小鼠中分离出对多种人体细胞有溶解作用的抗体，并把这种抗体识别的细胞表面蛋白分别称为Apo-1和Fas，后来经分子克隆出的cDNA证明Apo-1和Fas实际上为一种成分。1993年的第五届人类白细胞分化抗原分类国际会议将这种成分命名为CD95，它的相对分子质量为45000。Fas基因定位于人类10号染色体q24.1区和小鼠的第19号染色体，由其编码产生的Fas蛋白包含325个氨基酸，其N端有一个信号序列，穿膜区位于该蛋白分子中部，其胞浆区有一段长度为60～70个氨基酸序列，此序列含有3个周期性排列的完全半胱氨酸残基亚区，又被称为功能区或死亡区[5]。

Fas蛋白是一种细胞表面抗原，主要以膜受体形式存在，它还可以通过转录水平不同拼接或脱落产生可溶性的Fas分子。Fas蛋白与其配体（FasL）以及它们的可溶性形式共同构成了介导细胞凋亡的Fas系统。Fas属于肿瘤坏死因子与神经生长因子超家族成员，是位于细胞膜上的Ⅰ型跨膜受体[5]。FasL属于肿瘤坏死因子与神经生长因子受体超家族成员，FasL为Fas的配体[6]。以往研究表明，两者结合将启动细胞内死亡信号，导致Fas阳性细胞凋亡[5]。Fas/FasL系统是体内直接启动细胞凋亡的信号传导系统，它是机体维持稳定的一条重要途径，该系统的异常表达常与多种疾病的发生、发展有关[7]。

3.2 Fas蛋白与扩张型心肌病

DCM是一种原因不明的以心腔（左心室或右心室）扩大、心肌收缩功能减弱为主要特征的心肌疾病。临床表现为进行性加重的心力衰竭、心律失常甚至猝死。以往认为其发病机制主要与病毒感染后的自身免疫反应有关。80年代以后，遗传因素与DCM的关系逐渐受到重视，有人提出将DCM出现家族聚集的现象称为家族性扩张型心肌病（familial dilated cardiomyopathy，FDCM）[8]。近年来，在对心脏病的病因研究中，相继报道了细胞凋亡参与心脏疾病的可能性[9]。正常成熟个体的心肌细胞凋亡非常少见，只有当某种致病因素出现后，才可导致心肌细胞凋亡的大量发生，过度的心肌细胞凋亡将导致心力衰竭[10]。

有报道[11]表明DCM的发生和发展中也有细胞凋亡机制参与。另有研究[4]报道凋亡是DCM的心肌细胞丢失和心功能不全的重要机制，并且DCM是通过Fas/FasL系统介导心肌细胞凋亡；同时DCM患者存在免疫调节异常，这可能与心肌细胞凋亡有一定关系。因此，心肌Fas表达的改变与DCM的发病及猝死有密切的关系。

本研究应用免疫组织化学和图像分析技术，对DCM猝死者及其他死因的对照组心肌Fas蛋白表达情况进行定性定量检测，发现DCM猝死病例经免疫组织化学染色的心肌Fas蛋白表达明显增多，阳性着色在心肌纵切面细胞膜上及胞浆内呈棕黄色颗粒状或条状分布，横断面细胞膜见环形棕黄色颗粒带，而对照组未见明显变化，或仅在着色深浅程度上有轻度的变化，说明DCM猝死者心肌Fas蛋白表达明显增高，与对照组之间的差异明显，而心肌Fas蛋白表达的这种数量改变可能与DCM发生的因心律失常和心功能衰竭所致猝死有关。

虽然本研究用免疫组织化学SABC法对心肌Fas蛋白表达进行了初步研究，但由于心肌细胞凋亡可能是多因素共同作用的结果，故DCM猝死者心肌凋亡的机制仍不清楚。且本组资料的样本例数不多，故需进一步收集更多病例，进行多个凋亡因素表达的比较等方面的研究，以及进一步在分子水平上测量mRNA的变化或利用反义mRNA探针测定基因表达的变化，若能查清Fas蛋白的表达情况及其影响因素，并探讨有效控制其异常表达的方法和途径，可能更有助于DCM的诊断和治疗，从而为防治DCM、降低猝死的发生率以及DCM猝死的法医学鉴定提供更准确的参考资料。

[1] Mestroni L，Rocco C，Gregori D，et al.Familial dilated cardiomyopathy：evidence for genetic and phenotypic heterogeneity.Heart Muscle Disease Study Group[J].J Am Coll Cardiol，1999，34（1）：181-190.

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[3] Chen X，Zhang Y.Myocardial Cx43 expression in the cases of sudden death due to dilated cardiomyopathy[J]. Forensic Sci Int，2006，162（1-3）：170-173.

[4] 伍伟锋，刘唐威，陶新智，等.扩张型心肌病的心肌损伤与细胞凋亡[J].医学研究杂志，2006，35（3）：34.

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[8] Fuster V，Gersh BJ，Giuliani ER，et al.The natural history of idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Am J Cardiol，1981，47（3）：525-531.

[9] Narula J，Kolodgie FD，Virmani R.Apoptosis and cardiomyopathy[J].Curr Opin Cardiol，2000，15（3）：183-188.

[10]Haider N，Narual J，Hajar RJ，et al.Apoptosis in human explanted cardiomyopathic heart suggests programmed progression of dilated cardiomyopathy[J].Circulation，1995，92（8）：724.

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2012-02-03）

（本文编辑：张建华）

Expression of Fas Protein of Myocardium in Dilated Cardiomyopathy

WEI Shu-rong1,2,CHEN Xin-shan1,CHEN Huang-feng1,3,SUN Xu-peng1,4,HUANG Guang-zhao1
（1.Department of Forensic Medicine,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Criminal Investigation Detachment,Yiyang Public Security Bureau,Yiyang 413000,China;3.Department of Criminal Investigation,Wuhan Public Security Bureau,Wuhan 430019, China;4.Department of Forensic Medicine,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China）

Objective To investigate Fas protein expression of the myocardium in dilated cardiomyopathy（DCM）and its relationship with occurrence of sudden death caused by DCM.Methods Nine autopsy cases of sudden death caused by DCM along with the heart samples were chosen from the archives in the Department of Forensic Medicine,Tongji Medical College,HUST from 1997 to 2007.Other 11 cases which died of violence and other diseases were selected as the control group.Expressions of myocardial Fas protein in the samples were quantitatively detected by immunohistochemistry and computerized imaging analysis.Results Myocardial Fas protein expression increased significantly in the DCM group.Positive color showed brown-yellow granulated or striped distribution in the longitudinal section of myocardial within the cell membrane and cytoplasm,and showed circular brown granules in the cross section of the cell membrane,while these changes were not observed in the control group though there was focal weak staining noted.Statistical significance was observed between the experimental and control groups（P=0.002）,but no statistical significance was found for the average optical density value between these two groups（P=0.675）. Conclusion The expression of Fas protein increased obviously in the DCM group.Such alteration in expression quantity and distribution of myocardial Fas protein may be related to arrhythmia and heart failure in the patients with DCM.

forensic pathology;cardiomyopathy,dilated;immunohistochemistry;Fas protein

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.003

1004-5619（2012）04-0252-04

武汉市科技攻关计划项目（201060623254）

魏淑荣（1983—），女，湖北武汉人，硕士研究生，主要从事法医病理和法医物证的检案和科研工作；E-mail：lianxi19831225@yahoo.com.cn

陈新山，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事法医病理学教学、科研和检案工作；E-mail：xschen@mails.tjmu. edu.cn