金属盐离子对苦荞萌发及其总黄酮含量的影响

李晓丹 王 莉 王 韧 陈正行

金属盐离子对苦荞萌发及其总黄酮含量的影响

李晓丹 王 莉 王 韧 陈正行

(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江南大学，无锡 214122)

研究了在一定浓度的铝、锌、铜盐溶液浸种后，苦荞种子萌发7 d内发芽势、发芽率、粗蛋白含量的变化，并采用正交试验法设计，用吸光光度法测定样品中的总黄酮含量。结果表明，铝、锌、铜盐溶液浸种萌发对种子的芽苗生长和粗蛋白含量增加有促进的作用，而对发芽势和发芽率影响并不显著;正交试验发现对总黄酮含量影响因素显著性依次为萌发温度＞萌发时间＞金属盐种类，最佳萌发工艺条件为:金属盐种类为1 000 mg/L硫酸铝溶液，萌发时间为84 h，萌发温度25℃，在此工艺条件下，苦荞种子中总黄酮含量可以达到1 347．1 mg/100 g DW。

苦荞 萌发 粗蛋白 总黄酮含量

荞麦隶属蓼科(Polygonaceae)，荞麦属(Fagopyrum Mill．)，为非禾本科谷物，主要的栽培品种有2种，即甜荞麦(F．Esculentum Moench，普通荞麦)和苦荞麦［F．Tataricum(L．)Gaertn，鞑靼荞麦］［1］。

苦荞是一种营养价值很高的杂粮，其中蛋白质、脂肪含量远远高于大米、小麦;另外，在保健功能方面，苦荞中富含多种微生物、矿物质和膳食纤维，特别是含有丰富的生物类黄酮物质［2］。苦荞中的黄酮主要成分为芦丁(槲皮素－3－O－芸香糖苷)、槲皮素、山奈酚和桑色索等黄酮醇［3］。芦丁(Rutin)是苦荞含量最高的黄酮，质量分数高达1．08%～6．6%，是甜荞麦的9～300倍，占总黄酮质量分数的70%～85%，在降血压、降血糖、抗肿瘤和提高免疫力等方面具有相当重要的作用［4－5］。我国苦荞麦遗传多样性极为丰富，主要分为黄苦荞和黑苦荞，黄苦荞即普通苦荞，而黑苦荞外壳呈黑色，种植面积小，芦丁含量是黄苦荞的3～5倍，其营养价值要比黄苦荞高得多［6］。

谷物、豆类等经适当的发芽处理后，其化学成分均有所改变，营养价值得以提高并且形成独特的风味及口感。近年来研究发现苦荞及其芽苗中富含抗氧化的黄酮类物质和手性肌醇单体，将其作为一种新型的食物原料和蔬菜备受消费者青睐。种子在浸泡过程中使用适量浓度的盐液浸种，使植物机体产生抗逆性反应，在萌发中产生更多功能性物质［7－8］。近年来有研究表明，荞麦种子萌发后可使其蛋白质的组成有所改变［9－10］，消化率显著改善［11－12］;在铝浸种后，种子在萌发的过程中通过提高细胞内的POD和CAT活性、增加蛋白质和可溶性糖含量、提高黄酮类化合物的含量及其活性来提高荞麦的铝适应性［13－14］;通过在营养液中添加一些种子生长的必须微量元素，可使得芽苗产量显著增加，而这些芽苗中富集的微量元素亦对人体有益［15－16］。

因此，本试验研究了在一定萌发时间和温度下，用不同的金属盐溶液浸种后，黑苦荞种子的发芽率和芽长以及萌发的黑苦荞中粗蛋白和总黄酮含量的变化，以期为获得富含黄酮类物质的苦荞种子及芽苗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料与设备

黑丰1号:内蒙;次氯酸钠(CP)、硫酸铝、硫酸铜、硫酸锌、六水氯化铝、乙酸钾、乙醇、甲醇、浓硫酸、氢氧化钠:均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;溴甲酚绿－亚甲基红指示剂(3∶2)、芸香苷:国药集团化学试剂有限公司。

UV－1800型紫外可见分光光度计:上海美谱达(MAPADA)仪器有限公司;LRH－150生化培养箱:上海恒科学仪器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 苦荞种子萌发试验

苦荞种子经除杂后，用5%次氯酸钠浸泡30 min［17］，用去离子水冲洗干净。用一定浓度的盐液浸泡6 h［18］，浸泡温度与后萌发温度一致。双层去离子水湿润纱布铺于萌发容器内，将苦荞种子均匀的摊开，盖单层去离子水湿润纱布，在恒温培养箱中培养。定时收取萌发的苦荞种子50℃烘箱干燥，磨粉，过60目筛，供测定用。

苦荞种子的萌发容器是用细棉线交叉绑在搪瓷托盘上，将湿润的纱布铺在细棉线上，搪瓷托盘底部盛去离子水，纱布被棉线架空不与搪瓷托盘底部的去离子水接触，其中所用萌发器具和萌发空间均用75%的乙醇溶液消毒。

1．2．2 苦荞种子萌发状况的测定

测定发芽势、发芽率以及7 d内萌发种子的芽长是根据GB/T 3543．4—1995农作物种子检验规程发芽试验中所述的方法。

发芽势=4 d发芽的种子数/供试种子数×100%

发芽率=7 d发芽的种子数/供试种子数×100%

测定不同盐溶液浸种后萌发7 d内苦荞种子中粗蛋白含量是根据GB 5009．5—2010食品中蛋白质的测定中所述的凯氏定氮法并稍加改动。

1．2．3 试验设计

1．2．3．1 单因素试验

萌发中浸种盐液的种类及其浓度:本试验选用3种无机盐作为萌发时浸种的溶液进行试验对比，分别为硫酸铝溶液(浓度梯度为100、500、1 000、2 000、4 000 mg/L)、硫酸锌溶液(浓度梯度为100、300、500、700、900 mg/L)和硫酸铜溶液(浓度梯度为20、40、60、100、200 mg/L)。试验条件为萌发温度25℃，萌发时间72 h。

萌发温度:分别以15、20、25、30、35℃为萌发温度进行试验对比。浸种液均为水，萌发时间为72 h。

萌发时间:分别以48、60、72、84、96 h为萌发温度进行试验对比。浸种液均为水，萌发时间为25℃。

1．2．3．2 正交试验

在单因素试验基础上，确定上述3因素的上下临界限，按照L9(34)正交表进行正交试验。

1．2．3．3 萌发苦荞中总黄酮类物质的提取与测定

总黄酮类物质的测定方法是采用NY/T 1295—2007荞麦及其制品中总黄酮含量的测定中所述方法并稍加改动［19］。

提供取粉碎后样品0．2 g，精确至0．000 1 g，置于150 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇溶液30 mL，将三角瓶置于(65±2)℃的恒温水浴震荡器中在(130±10)r/min的振荡频率下振摇6 h，趁热用离心机于3 000 r/min离心，上清液置于50 mL容量瓶中，冷却至室温，用70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，为试样待测液。

采用分光光度法，以标准芦丁为参照物进行测定。

标准曲线的绘制:用移液管分别吸取芦丁标准溶液0．25、0．50、1．0、2．0、3．0、4．0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入三氯化铝溶液2 mL、乙酸钾溶液3 mL，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30 min。同时做空白。标准曲线中芦丁含量分别为0．001 25、0．002 50、0．005 00、0．010 0、0．015 0、0．020 0 mg/mL。在波长420 nm处测定吸光度。以吸光度值为横坐标，浓度值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中总黄酮含量的测定:准确吸取1．0 mL试料待测液置于10 mL容量瓶，其他操作与标准曲线的绘制相同。

1．2．3．4 萌发苦荞中金属盐离子残留的测定

铝离子残留量的测定采用GB/T 5009．182—2003面制食品中铝的测定中所述方法［20］并稍加改动。铜离子和锌离子残留量的测定方法是采用GB/T 14609—2008粮油检验谷物及其制品中铜、铁、锰、锌、钙、镁的测定火焰原子吸收光谱法［21］。

1．2．4 统计方法

相关数据用SPSS软件处理，P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异极显著。

2 结果与分析

2．1 不同浸种液及萌发时间对苦荞种子生长状况的影响

种子浸种后，按照1．2．1和1．2．2中所述方法在25℃下对苦荞种子进行7 d萌发并测定其发芽势、发芽率和芽长，结果见表1，图1。萌发状况的测定中Al3+、Zn2+和Cu2+质量浓度分别为1 000、500和60 mg/L，对照组浸种液为水。

表1 不同溶液浸种萌发后苦荞种子的发芽势和发芽率

苦荞种子在萌发12 h后均吸水膨胀，偶有露白，12～24 h中大部分种子有出芽现象，芽长约0．2 cm。从表1中可以看出，与水浸种萌发相比，金属盐浸泡萌发对苦荞种子的发芽势和发芽率并无显著影响，3种盐溶液在发芽势和发芽率也没有明显的区别。

但由图1中可知，较水浸种萌发，经盐溶液浸种后的种子芽长更长，同样时间内生长速度更快，得到的芽体更多。另外，3种盐溶液中铝盐浸种后的芽体生长情况最好，萌发7 d时芽体长达7．34 cm，比水浸种萌发7 d时增加了22．07%，有利于增加产量，而锌与铜盐浸种后效果区别不大，但都优于水浸中的效果。综上所述，经盐溶液浸种的苦荞种子芽体生长比水浸种后种子生长速度快，同时间内芽体更长。

图1 不同溶液浸种萌发后苦荞种子的芽长

2．2 不同浸种液及萌发时间对苦荞种子中粗蛋白及黄酮含量的影响

2．2．1 浸种液及萌发时间对粗蛋白含量的影响

经测定，本试验所用原料中所含粗蛋白含量为17．76 g/100 g DW。苦荞种子经水浸种后，萌发0～1 d时，蛋白质含量略有下降，1～4 d时蛋白质含量随萌发时间的延长而增加，于第4天时达最大值19．52 g/100 g DW，之后5～7 d随萌发时间延长，蛋白质含量下降，至第7天含量下降至15．85 g/100 g DW。而经铝、铜、锌溶液浸种后的苦荞种子，萌发0～2 d时，蛋白质含量持续下降，随后2～7 d，经铝和铜溶液浸种后的种子蛋白质含量随时间延长而增加，至第7天含量达最大值，分别为21．87、22．95 g/100 g DW，而经锌溶液浸种后的种子蛋白质含量在2～6 d中持续增加，至第6天达最大值21．20 g/100 g DW，之后含量急剧下降。综上所述，盐溶液浸种对萌发的苦荞种子萌发后期蛋白质分解用于芽体自身生长起到了一定抑制的作用，并在萌发过程中有利于蛋白质含量的增加。但增加的蛋白质是否易于消化吸收则有待于做进一步的探讨。

图2 苦荞种子经不同盐溶液浸种后萌发7d内粗蛋白含量

2．2．2 浸种盐液的种类及其浓度对苦荞种子中总黄酮含量的影响

未萌发的苦荞种子中总黄酮含量为572．3 mg/100 g DW。

不同浸种盐液及其浓度对苦荞中总黄酮含量的影响见图3，萌发温度和时间均为25℃、84 h。

图3 不同质量浓度的3种盐溶液浸种后对总黄酮含量的影响

由图3可以发现，用硫酸铝溶液浸种时，当溶液质量浓度为1 000 mg/L，样品中总黄酮含量最高，比未萌发样品中总黄酮含量增加125．15%，比用水浸种萌发后所得样品含量增加21．92%，随着硫酸铝溶液浓度增大，其总黄酮含量减小，并趋于平缓;用硫酸锌溶液浸种时，当溶液质量浓度为500 mg/L，样品中总黄酮含量达最大值，比未萌发样品含量增加116．84%，与水浸种相比增加17．46%;用硫酸铜溶液浸种时，当溶液质量浓度增至60 mg/L时，样品中总黄酮含量最高，比未萌发样品含量增加118．35%，比水浸种增加24．53%，之后含量随浓度增加而下降并趋于稳定。

综上所述，用所选3种盐溶液浸种后的萌发苦荞中所含总黄酮含量与未萌发种子相比均大幅度增加。每种溶液最佳浓度有所不同，Al、Zn、Cu 3种盐液浸种的最佳质量浓度分别为1 000、500、60 mg/L。3种盐液低浓度浸种时，萌发种子中总黄酮含量均比水浸种含量略低，但随着浓度适量增加，总黄酮含量大幅度增加，浸种盐液浓度继续增加，总黄酮含量反而呈现出了下降的趋势，并趋于平缓。另外，此处所选3种浸种盐对于促进种子总黄酮含量增加的原理并不相同，Al盐是对种子产生毒害机制，使种子对其产生抗逆性而增加植物中对人类有益成分的含量;而Zn是种子生长所必需一种元素，用Zn盐浸种可使种子生长速度加快;Cu既是种子生长的必需元素，在一定浓度下也会对种子产生毒害机制，从两个方面对种子进行胁迫。

2．2．3 萌发时间与萌发温度对苦荞种子中总黄酮含量的影响

由图4a可以发现，随着萌发时间的增加，苦荞种子中的总黄酮含量呈增长趋势，48～60 h阶段增长速度较为缓慢，至72 h时含量比60 h时大幅度增加，与水浸中相比增加到72～96 h阶段含量虽有增加，但速度缓慢，萌发96 h时总黄酮含量仅比72 h增加5．53%。但是，过长的萌发时间会提高种子霉变的几率，影响芽体的生长，污染其他种子，使种子的萌发过程不易控制，因此种子的萌发时间不宜超过96 h。

图4 萌发时间与萌发时间对总黄酮含量的影响

由图4b中可见，当温度为25℃是，种子中总黄酮含量最高;当温度为30℃时，种子中总黄酮含量呈现出明显降低的趋势。苦荞为耐寒植物，较高的温度不适合苦荞种子的生长。

2．3 萌发苦荞的工艺优化试验

通过对苦荞种子中总黄酮含量的单因素分析，得出如下工艺参数范围:浸种盐液为1 000 mg/L的硫酸铝溶液、500 mg/L的硫酸锌溶液和60 mg/L的硫酸铜溶液;萌发时间为60～84 h;萌发温度为20～30℃。为了得到最佳的提取效果，以苦荞种子中总黄酮含量作为指标，对上述因素进行正交优化试验，结果见表1。

表1 因素水平表

由表2可以发现，影响因素的显著性大小关系为:萌发温度＞萌发时间＞浸种盐种类。

表2 优化试验以及直观差分析表

由表3可知，3个因素均对苦荞种子中的总黄酮含量有显著性影响，其中萌发温度对其有非常显著的影响。由此可确定使用盐浸种萌发苦荞种子的最佳条件为:浸种盐为1 000 mg/L硫酸铝溶液，萌发时间为84 h，萌发温度为25℃。在此工艺下，苦荞种子中的总黄酮含量可以达到1 347．1 mg/100 g DW，比未萌发种子中的含量增加了135．38%。

表3 结果方差分析表

由于在种子浸种吸水的过程中运用了金属离子盐溶液浸种，因此分别对正交中3种离子的最优结果即最佳条件所得样品、9号样品和4号样品进行了Al、Cu和Zn元素残留量的测定。结果表明，最佳条件所得样品中Al元素残留量为13．110 mg/kg，9号样品中Cu元素残留量为8．096 mg/kg，4号样品中Zn元素残留量为44．07 mg/kg，均小于GB 2760—2011［22］和NY 861—2004［23］中Al、Cu、Zn元素的限量(分别为100，10，50 mg/kg)。因此，使用这3种金属盐离子浸种萌发不但使苦荞中的功能性物质总黄酮含量大幅度增加，而且并未使其中Al、Zn和Cu元素含量超标。

3 讨论与结论

苦荞种子在萌发12 h后均吸水膨胀，偶有露白，12～24 h中大部分种子有出芽现象，芽长约0．2 cm。相较于水浸种萌发，一定浓度的盐溶液浸种萌发对苦荞种子的发芽势和发芽率没有显著的影响，但对于种子芽体生长的影响较为显著，其中铝离子浸种后萌发的效果最好，锌与铜的效果次之。但是，过高的盐溶液浓度可能由于其本身毒性过大而对苦荞的萌发起到一定的抑制作用，从而使苦荞中的发芽率和芽苗产量降低，而过低的盐溶液浓度有可能因有效元素含量过低而对其萌发的影响不显著［24］。因此，浸种盐液的浓度还需进一步研究。

经盐溶液浸种后的苦荞种子在萌发0～4 d内蛋白质含量比水浸种中含量增加速度慢。但在4～7天，经水浸种的种子中的蛋白质含量由第4天的最大值开始随时间增加而下降，而经盐溶液浸种后的种子中含量则以不同速度增加，并且分别在第6天和第7天达最大值。由此可见，相较于水浸种，金属盐离子浸种可使苦荞种子在萌发中后期蛋白质含量显著增加，但其蛋白构成的变化及其消化率则需做进一步研究。

对比多种不同浓度的盐溶液的浸种萌发效果，由此可以确定各种盐溶液的最佳浓度，3种盐溶液的最佳萌发浓度分别为:硫酸铝溶液1 000 mg/L，硫酸锌溶液500 mg/L，硫酸铜溶液60 mg/L。经正交分析后，得出的最佳萌发工艺条件为:浸种盐种类为1 000 mg/L硫酸铝溶液，萌发时间为84 h，萌发温度25℃。在此工艺下，苦荞种子中总黄酮含量可以达到1 347．1 mg/L，比未萌发种子中的含量提高了135．38%，与传统水浸中萌发后含量提高了27．45%。同时对样品中的铝、铜、锌元素残留量进行检测，与国标限量相比并未超标。

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Effect of Metallic Ions on Germination and Seedlings Physiology and the Content of Flavones in Black Tartary Buckwheat

Li Xiaodan Wang Li Wang Ren Chen Zhengxing
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology/Jiangnan University，Wuxi 214122)

The influence of aluminum，zinc and copper on the seedling physiology，crude protein and total flavones of black tartary buckwheat was studied．Absorptiophotometry was applied to determine the content of total flavones in black tartary buckwheat through L9(34)orthographic experiments．The result showed that the effect of Al，Zn and Cu solution played a notable role in the length and the content of protein of the seeds increasing during the germination stage，whereas had few influences on seed germination and its rate;based on the consequences of the single factor and orthographic experiments，the best germination processing parameter was ascertained as follows:the steeping solution 1 000 mg/L aluminum sulfate solution，germination time 84 h，temperature 25℃．In the above－mentioned condition，the content of total flavones in black tartary buckwheat would increase to 1 347．1 mg/100 g(DW)．

back tartary buckwheat，germination，protein，total flavones

S517

A

1003－0174(2012)10－0026－06

2012－12－20

李晓丹，女，1988年出生，硕士，粮食油脂及植物蛋白

陈正行，男，1960年出生，教授，谷物化学