巴西松籽蛋白超声辅助超滤提取工艺及功能特性研究

蔡路昀 刘长虹 曹爱玲 应铁进

巴西松籽蛋白超声辅助超滤提取工艺及功能特性研究

蔡路昀1刘长虹1曹爱玲2应铁进1

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院1，杭州 310058)
(萧山出入境检验检疫局2，杭州 311208)

为了提高巴西松籽蛋白提取效率和功能特性，采用超声辅助超滤提取工艺结合响应面分析，并与传统提取工艺松籽蛋白进行比较。结果显示:超声辅助超滤提取工艺可以显著提高松籽蛋白的得率和功能特性，其中最佳提取条件是:超声温度43℃，pH值9，超声功率400 W，超声时间38 min，料液比1∶35，提取效率为77．94%，同时超滤提取的松籽蛋白在容积密度，乳化性，起泡能力和起泡稳定性等功能特性上都要优于传统提取的松籽蛋白及部分植物蛋白。这些结果表明，松籽蛋白作为可利用的植物蛋白来源可以广泛应用于食品工业中。

松籽蛋白 超声 超滤 响应面 功能特性

巴西松籽(Pinus gerardiana W．ex D．)主要分布在喜马拉雅山区，如阿富汗东部，巴基斯坦北部，印度查谟克什米尔地区和我国的西藏，常年生长在海拔2 000～3 350 m的山谷中。巴西松籽作为一种地区贸易商品，消费潜力巨大，由于其营养成分丰富，其不饱和脂肪酸占总脂肪酸的91．54%［1］，同时与国内红松松籽相比，更易手剥食用，近年来在国内的消费量呈现逐年上升的态势。巴西松籽以烘炒为主要加工手段，可用于甜食、paste中或者作为色拉的配料，但对其精深加工的相关研究甚少。多年来，植物蛋白作为一种来源丰富的高品质蛋白质受到极大关注［2－3］，作为植物蛋白的松籽蛋白占总成分的20%以上，且氨基酸组成合理，尤其富含精氨酸［4］，可降低因心血管疾病引发的风险，因此，研究松籽蛋白的提取工艺对松籽资源的开发利用具有重要意义。

超滤技术是食品工业中最受人欢迎的分离技术之一，能截留大分子蛋白质从而去除小分子物质［5］，能去除一些抗营养的成分，如蛋白酶和淀粉酶抑制剂，外源凝集素等，同时改善蛋白的功能性质［6－7］。超声辅助处理通过减少处理时间和溶剂损耗从而显著改进提取效率，也可以改善蛋白的理化及功能特性［8－9］。近年来，国内学者利用碱溶，超声辅助提取，盐溶等提取松籽蛋白，然后采用等电点沉淀等方法进行分离，取得了一定的效果［10－11］，在提取率上有所提高，但在蛋白质的稳定性和功能特性上没有改进，国外甚少有关于松籽蛋白的分离提取研究，通过超声辅助提取松籽蛋白，同时用超滤技术分离蛋白的研究鲜见报导，因此，本试验通过超声辅助提取和超滤分离松籽蛋白，利用响应面分析(RSM)优化松籽蛋白的提取工艺并测定所得松籽蛋白的化学组分和功能特性，以期为松籽蛋白的开发应用提供技术指导。

1 材料与方法

1．1 材料

巴西松籽(Pinusgerardiana W．ex D．)于2010年9月采自巴基斯坦北部山区，海拔2 000米以上，采收后冷藏空运回国，去除杂质和坏籽，放入塑料罐中，封口，然后在－3℃储存备用。

1．2 仪器与设备

Kjeltec2300全自动凯氏定氮仪:丹麦Foss公司;KQ500DB超声波清洗器:昆山超声仪器有限公司;722E型可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;Labscale型TFF超滤系统:美国Millipore公司;BR4i冷冻离心机:法国Jouan公司;Alpha 1－4 LSC冷冻干燥机:德国Christ公司。

1．3 松籽蛋白的制备工艺流程

松籽蛋白的制备工艺流程如下所示。

新鲜巴西松籽→正已烷脱脂(×2)→干燥粉碎→超声辅助提取→离心取上清→超滤分离→冷冻干燥→松籽蛋白

1．3．1 去脂松籽粉的准备

巴西松子仁磨碎后，与正己烷按照1:10比例混匀，然后磁力搅拌提取1 h，去上清，重复提取1次，将剩余物放在通风橱中干燥以去除水分和残留的溶剂，最后将已去脂的松籽磨成粉，过80目筛，放入密封的塑料袋中，－20℃保存待用。

1．3．2 超声辅助提取与响应面优化设计

称取1 g去脂松籽粉，根据不同的提取参数(pH，料液比，超声温度，超声功率，超声时间)进行单因素试验，基于单因素试验的结果，以松籽蛋白的提取率为响应值，根据Box－Behnken中心组合试验原理，用响应面方法来评估不同参数对蛋白质提取率的影响，并最终得出优化的提取条件。

以松籽蛋白的提取率作为响应值，根据Box－Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，选择超声温度X1，超声处理时间X2，料液比X3这3个因素，设计3因素3水平的响应面设计(RSM)，共设立了17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点，用来估计误差，试验设计因素及水平如表1所示，试验方案及结果见表2。

表1 RSM试验设计的因素及水平

表2 RSM试验方案及结果

蛋白提取率=(提取液中的蛋白含量/去脂粉中的蛋白含量)×100%，去脂粉中的蛋白含量根据凯氏定氮法测定，其中氮转化因子N=5．30，提取液中的蛋白质含量用Bradford的方法进行测定。

1．3．3 超滤制备松籽蛋白

蛋白提取液匀浆在5 000 r/min，4℃条件下离心20 min，上清液用分离点10 ku的滤膜进行切向流超滤，调节蛋白提取物pH值至7．0，然后真空冷冻干燥得到松籽蛋白(UPP)。同时与传统碱提酸沉的松籽蛋白(IPP)进行对比分析。

1．4 松籽蛋白的化学组分和功能特性

1．4．1 大致组分测定，其中粗蛋白含量测定:凯氏定氮法(GB5009．5—2010);粗脂肪含量测定:索氏提取法(GB5512—2008);水分含量测定:105℃恒重法(GB5497—1985);灰分含量测定:550℃灼烧法(GB5505—1985)。

1．4．2 容积密度采用文献［12］的方法，松籽蛋白的容积密度用每毫升蛋白的重量来表示(g/mL)。

1．4．3 最小凝胶浓度通过文献［13］的方法测定，将松籽蛋白用蒸馏水调节成不同浓度的溶液，首先在沸水浴加热1 h，而后迅速冷却并放入4℃冰箱中2 h，最后将管子倒置过来而样品没有掉落即为最小凝胶浓度。

1．4．4 乳化性采用文献［14］的方法，取一定量松籽蛋白溶解到50 ml 0．1 mol/L的NaCl溶液中，在调整pH后，加入50 mL大豆油，在高速匀浆机中搅拌3 min，然后转移到量筒中并在25℃保持15 min，记录下乳化层体积和总体积，其中乳化性=(乳化层体积/总体积)×100%。

1．4．5 起泡性采用文献［15］的方法，进行略微修改，取0．1 g松籽蛋白溶解到20 mL去离子水中，调节pH，15 000 r/min搅拌2 min后倒入量筒中，15 s和120 min后分别记录起泡的体积，其中起泡能力=(15 s后起泡的体积/搅拌前体积)×100%，起泡稳定性=(静置120 min后起泡的体积/静置前起泡的体积)×100%

1．5 数据统计

所有试验重复3次，数据均以平均数±标准差表示，数据处理采用SAS软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2．1 松籽蛋白超声辅助提取的最佳条件

选取超声处理时间、超声温度、pH值、超声功率、料液比共5个因素进行单因素试验，以此来测定各个因素对松籽蛋白提取率的影响。

pH值对蛋白提取率的影响，设置料液比1∶20，超声温度35℃，超声功率400 W，超声处理时间30 min(图1a)，结果显示，松籽蛋白的提取率伴随着pH值的升高而显著增加，说明碱性pH可以疏松蛋白结构，增加蛋白溶解性，但是过高的碱性也会导致蛋白发生变性，破坏蛋白品质。因此选择pH 9作为松籽蛋白提取的条件。

料液比对蛋白提取率的影响，设置pH 9，超声温度35℃，超声功率400 W，超声处理时间30 min(图1b)，结果显示，随着料液比增加，蛋白提取率增加，但当料液比达到1:30后提取率没有显著增加，因此选择料液比1:30作为提取条件。

超声温度对蛋白提取率的影响，设置pH 9，料液比1:30，超声功率400 W，超声处理时间30 min(图1c)，当提取温度从25℃升至45℃，提取率显著增加，而当温度继续升高，提取率非但没有上升，反而呈下降趋势，这归因于高温所引发的蛋白质变性，形成絮状沉淀从而降低了蛋白质的溶解度［16］。因此选择温度45℃作为蛋白提取的条件。

超声功率对蛋白提取率的影响，设置pH 9，料液比1∶30，超声温度45℃，超声处理时间30 min(图1d)，在400 W之前，蛋白提取率随着超声功率的增加而增加，400 W之后，随着超声功率增加，提取率非但没有增加反而减少，这可能是由于超声功率过大，会导致细胞内一些降解蛋白酶溶出，从而降低蛋白得率［9］。

超声处理时间对蛋白提取率的影响，设置pH 9，料液比1∶30，超声温度45℃，超声功率400 W(图1e)，提取时间在20～40 min内，蛋白提取率显著升高，在40 min时，达到最大值75．44%，40 min后，提取率逐渐下降，这可能是由于长时间超声处理所产生的热效应破坏蛋白结构，从而降低了蛋白的提取率。

图1 不同因素对松籽蛋白提取率的影响

采用Design expert 7试验统计软件对17个试验点的响应值进行二次回归拟合，得到回归方程:

进一步对回归模型进行分析，发现P值远低于0．01，这说明Quadratic模型是显著的，同时失拟误差的P值大于0．05，回归方程的系数R2=0．974，这些都说明此模型可被用来预测响应值。

为确定松籽蛋白超声辅助提取的最优条件，根据预测方程进行了三维曲面图分析。从图2中可以发现，3个响应面都是凸面的，而且3个因素与蛋白提取率之间存在抛物线关系。对回归方程进行数学分析得出，超声辅助提取的最佳条件是:超声温度42．91℃，超声处理时间37．53 min，料液比1∶35，此时蛋白的理论提取率是78．34%，考虑到实际情况，将提取条件修正为超声温度43℃，超声处理时间38 min，料液比1∶35，超声功率400W，pH值为9，为进一步验证模型的有效性，用所得的优化条件重复试验3次，测得松籽蛋白提取率为77．94%，和理论提取率相近，与传统的提取方法相比(62．09%)，超声辅助提取的松籽蛋白提取率提高了26%，因此超声辅助有助于显著提高松籽蛋白的提取率。

2．2 松籽蛋白的大致组分

通过超滤提取的巴西松籽蛋白(UPP)和传统提取的巴西松籽蛋白(IPP)的大致组分如表3所示，超滤松籽蛋白比传统提取的松籽蛋白含有更高的蛋白含量(P＜0．01)，更少的脂肪，水分和灰分。同时，经过超滤后，去除了小分子质量肽段，分离物具有不同的蛋白分段，由此，蛋白所具有的一些对食品加工重要的理化及功能特性可能会产生变化。

图2 温度和时间、温度和料液比、时间和料液比对松籽蛋白提取率的响应面图

表3 巴西松籽蛋白UPP和IPP的大致组分

2．3 超滤分离巴西松籽蛋白的功能特性

2．3．1 巴西松籽蛋白的容积密度和最小凝胶浓度

表4所示的是通过超滤和传统提取方法提取的松籽蛋白的容积密度和最小凝胶浓度。可以看出，超滤松籽蛋白的容积密度(0．35 g/mL)要高于传统提取松籽蛋白(0．28 g/mL)，也高于通过超滤提取的葵花籽蛋白(0．27 g/mL)［17］，容积密度取决于相关因素的相加效应，比如相互吸引的颗粒间的强度，颗粒大小和接触点的数量等等，更高的容积密度有利于婴幼儿食品制作中减少产品的容积［18－19］

超滤提取松籽蛋白的最小凝胶质量分数(12%)高于传统提取松籽蛋白(8．67%)，这个结果与测得的大豆蛋白(9．7%～11%)，菜籽蛋白(14．9%～15．7%)［20］，葵花籽蛋白(10%)［21］的最小凝胶浓度相类似。凝胶过程是一个多步骤的过程，依赖于蛋白的来源和类型还有试验的条件等等，其中所含有的非蛋白成分可能占据了重要的作用［22－23］。

2．3．2 巴西松籽蛋白的乳化性和起泡性

超滤提取松籽蛋白(UPP)与传统提取松籽蛋白(IPP)的乳化性和起泡性如表4所示。乳化性是蛋白的重要功能特性之一，蛋白质的亲水疏水双重性质有利于显著减少油水界面之间的强度和空隙［24］，UPP的乳化性要高于IPP，且高于已知的花生蛋白和葵花籽蛋白的乳化性［12，17］，进一步说明了松籽蛋白可作为一种优质植物蛋白应用在食品工业中。

蛋白的起泡能力主要取决于他的可溶性蛋白片段，但是不溶性的蛋白颗粒或者其他成分比如碳水化合物的存在对起泡性能也起到一定的作用［25］。研究结果显示，超滤提取的松籽蛋白的起泡能力和起泡稳定性要均好于传统提取的松籽蛋白，说明不同的蛋白分离方法产生了不同的蛋白片段和其他的化学组分，这些共同决定了蛋白的起泡性能。

表4 巴西松籽蛋白的功能性特性

3 结论

超声辅助超滤提取显著优于传统的提取方法，同时提高了松籽蛋白的得率和功能特性。巴西松籽蛋白良好的乳化性可以用在色拉、蛋黄酱等制作上，较好的起泡性可以用在制作蛋糕、冰淇淋和甜点上，以上结果均显示巴西松籽蛋白可以在食品工业中作为好的蛋白质配方的来源之一。

［1］Destaillats F，Cruz－Hernandez C，Giuffrida F，et al．Identification of the botanical origin of pine nuts found in food products by gas－liquid chromatography analysis of fatty acid profile［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2010，58:2080－2087

［2］苏晓雨，王振宇．植物来源生物活性蛋白研究进展［J］．食品工业科技，2008，29(12):293－296

［3］Enujiugha V N，Ayodele－Oni O．Evaluation of nutrients and some anti－nutrients in lesser－known，underutilized oilseeds［J］．International Journal of Food Science and Technology，2003，38:525－528

［4］Venkatachalam M，Sathe SK．Chemical composition of selected edible nut seeds［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2006，54(13):4705－4714

［5］Mondor M，Aksay S，Drolet H，et al．Influence of processing on composition and anitinutritional factors of chick pea protein concentrates produced by isoelectric precipitation and ultrafiltration［J］．Innovative food science and emerging technologies，2010，43(6):537－546

［6］Fredrikson M，Biot P，Alminger M L，et al．Production process for high quality pea protein isolate with low content of oligosaccharides and phytate［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(3):1208－1212

［7］Fuhrmeister H，Meuser F．Impact of processing on functional properties of protein products from wrinkled peas［J］．Journal of Food Engineering，2003，56(2－3):119－129

［8］金梅，赵瑞昌，姜东，等．响应面法优化麦麸蛋白超声波－酶法提取工艺［J］．中国粮油学报，2010，25(8):6－14

［9］王立峰，朱均旺，袁建，等．超声波辅助反胶束提取菜籽蛋白工艺优化［J］．中国粮油学报，2010，25(5):45－48

［10］苏晓雨，王振宇，李颖．超声辅助提取松仁蛋白工艺的响应面法优化［J］．食品研究与开发，2008，29(12):45－49

［11］吴晓红，郑月明，付兆龙，等．两种提取红松种子蛋白质的工艺方法比较研究［J］．中国林副特产，2009，101(4):1－5

［12］Monteiro P V，Prakash V．Functional properties of homogeneous protein fractions from peanut(Arachihypogaea L．)［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry．1994，42:274－278

［13］Abbey B W，Ibeh，G O．Functional properties of raw and heat processed cowpea flour［J］．Journal of Food Science，1988，53:1775－1791

［14］Chau C F，Cheung P C．Functional properties of flours prepared from three Chinese indigenous legume seeds［J］．Food Chemistry，1998，61:429－433

［15］Sze－Tao K W C，Sathe S K．Functional properties and in vitro digestibility of almond(Prunus dulcis L．)protein isolate［J］．Food Chemistry，2000，69:153－160

［16］陶健，毛立新，杨小姣，等．荞麦蛋白的功能特性研究［J］．中国粮油学报，2005，20(5):46－56

［17］Jose A U，Petra R－U，Blanca E U．Physicochemical and functional properties of a protein isolate produced from safflower(Carthamus tinctorius L．)meal by ultrafiltration［J］．2010，91(3):572－577

［18］Peleg M，Bagley E B．Physical properties of foods［M］．Westport，CN:AVI Pub．Co．1983:532－539

［19］Padmashree T S，Vijayakshmi L，Puttaraj J．Effect of traditional processing on functional properties of cowpea(Vigna catjang)［J］．Journal of Food Science and Technology，1987，24:221－224

［20］Khattab R Y，Arntfield SD．Functional properties of raw and processed canola meal［J］．LWT－Food Science and Technology，2009，42:1119－1124

［21］Gonzalez－Perez S，Vereijken M．Review:Sunflower proteins:overview of their physicochemical，structural and functional properties［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2007，87:2173－2191

［22］Leggett G．Color measurement technique for food products．In color quality of fresh and processed foods［M］．Culvar C．，Wrolstad R．，Eds．Washington DC:American Chemical Society，2008:14

［23］Deshpande S S，Sathe S K，Cornforth D P，et al．Effects of dehulling on functional properties of dry bean flours［J］．Cereal Chemistry，1982，59，396－401

［24］Yu J，Ahmedna M，Goktepe I．Peanut protein concentrate:production and functional properties as affected by processing［J］．Food Chemistry，2007，103:121－129

［25］Sathe SK，Deshpande SS，Salunkhe D K．Functional properties of lupin seed(Lupinis mutabilis)proteins and protein concentrates［J］．Journal of Food Science，1982，47:491－497．

Study on Functional Properties of Chilgoza Pine Nut Protein Extracted by Ultrasonic－Assisted Ultrafiltration

Cai Luyun1Liu Changhong1Cao Ailing2Ying Tiejin1
(School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310058)
(Xiaoshan Entry－ E xit Inspection and Quarantine Bureau2，Hangzhou 311208)

In this study in order to increase the extraction efficiency and functional properties of Chilgoza pine nut protein，prepared by ultrasonic－assisted extraction and ultrafiltration in combination with response surface methodology were analyzed in comparison with the protein obtained by traditional extraction．The extraction efficiency and functional properties of pine nut protein was significantly improved by the ultrasonic－assisted extraction and ultrafiltration method．The optimum extraction condition was as follows:ultrasonic temperature 43℃ ，pH value 9，ultrasonic power 400 W，ultrasonic treatment time 38 min，solid/liquid ratio 1:35，the extraction efficiency was 77．94%．Functional properties(bulk density，emulsifying capacity，foaming capacity and foam stability)of pine nut protein obtained by ultrafiltration were found to be better than that of traditionally extracted protein and some of other plant proteins．The results of this study indicated pine nut protein as an available plant protein source could be widely applied in food industry．

pine nut protein，ultrasonic，ultrafiltration，response surface，functional properties

TS201．2

A

1003－0174(2012)10－0070－06

2012－01－13

蔡路昀，男，1981年出生，博士，农产品储藏加工

应铁进，男，1958年出生，教授，博士生导师，农产品储藏加工