麦胚谷胱甘肽提取与含量测定方法研究

刘 千 陈 黎 胡用军 叶凤琴 陈 强

麦胚谷胱甘肽提取与含量测定方法研究

刘 千1陈 黎2胡用军2叶凤琴2陈 强3

(四川农业大学农学院1，温江 611130)
(宜宾市产品质量监督检验所2，宜宾 644002)
(四川农业大学食品学院3，雅安 625014)

旨在建立用反相高效液相色谱(RP－HPLC)法同时检测小麦胚中谷胱甘肽(glutathione)还原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)含量的方法。为了更高效地提取谷胱甘肽，在水作溶剂条件下，考察了不同浸泡时间、超声时间、料液比、超声温度、溶剂pH和沉淀剂比例对谷胱甘肽提取效率的影响。并在2种色谱柱上，考察了5种流动相下谷胱甘肽含量测定结果。最终确定最适提取条件为:提取溶剂pH 4．0，料液比1∶30，浸泡1 h后在0℃下超声10 min，沉淀剂比例为1∶2．0;色谱条件为:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8);检测波长为210 nm;流速为1．0 mL·min－1;柱温为25℃。测定了19份不同来源麦胚中谷胱甘肽的含量，发现谷胱甘肽含量差异显著，最高达180．71 mg·(100 g)－1。

麦胚 谷胱甘肽 提取 含量

谷胱甘肽(glutathione)是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的活性三肽，有还原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)2种形态，在生理条件下以还原型占绝大多数。国外早在20世纪二三十年代就开始了对其生理功能的研究［1］。它能保护生物膜、抗衰老、解毒、抗癌、预防动脉硬化及抑制饮酒过度而引起的脂肪肝，也是细胞内主要还原型物质，能保护细胞免受氧化及有毒物质的损伤［2］。随着对谷胱甘肽研究的深入，其在食品［3－4］、医学［2］、保健［5－6］、抗衰老［7］等方面的应用正日益引起人们的广泛关注。谷胱甘肽作为功能活性因子，是制作功能性食品的理想添加剂［3］。

目前，食品工业中已广泛使用抗氧化剂，但绝大多数属人工合成，随着人们越来越关心食品安全问题，天然谷胱甘肽的强抗氧化活性和高安全性，在保健食品等领域将有极好的应用前景［8］。而谷胱甘肽在自然界含量丰富，尤其在小麦胚中含量最多，高达0．47%［9］。当前，对麦胚营养价值、功能特性和麦胚稳定化技术以及麦胚应用的研究较多，但关于麦胚中谷胱甘肽含量测定方法研究较少，仅见曹新志等［10］采用荧光法进行。麦胚中谷胱甘肽的提取方法有刘国琴等［11］用浸提法，周惠明等［12］用离子交换分离法，卢敏等［13］用高压电脉冲法，尚未见用超声提取法。

目前，常见的测定其他植物或食品中谷胱甘肽含量包括紫外分光光度法、酶法、荧光光度法、电化学法和高效液相色谱法等［5－6，14－16］。其中，高效液相色谱法因具有灵敏性高，专一性强，线性范围宽，稳定性较高等特点应用范围越来越广。

本研究比较了不同浸泡时间、超声时间、料液比、超声温度、溶剂pH和沉淀剂比例对谷胱甘肽提取效率的影响，力求更高效地从小麦胚中提取谷胱甘肽，并建立同时测定小麦胚中GSH和GSSG含量的HPLC法，为麦胚功能性食品方面的开发和麦胚中谷胱甘肽的提取、测定提供一定科学依据。

1 材料与方法

1．1 供试材料

19份不同来源小麦生/熟胚为供试样品，样品编号及来源见表1。样品粉碎过40目筛后烘干保存备用。选取1号材料进行提取条件和色谱条件试验。

表1 供试材料19份小麦胚的来源

1．2 仪器与试剂

KQ－100B超声波清洗机:昆山超声波仪器公司;UV－265型紫外－可见分光光度仪、高效液相色谱仪［SPD－10A VP紫外－可见检测器、LC－6A高压泵、CTO－10AS VP柱温箱(含7725i型手动进样器)，浙大智达N2000工作站］:Shimadzu公司;CP225D型电子天平:Sartorius公司;Milli－Q型纯水仪:Millipore公司。

GSH和GSSG对照品:Sigma公司;辛烷磺酸钠:上海蓝季科技发展有限公司;色谱纯乙腈、分析纯磷酸二氢钠、氯仿等其余试剂:成都市科龙化工试剂厂。

1．3 供试品溶液的制备

按表2中的试验设计顺序逐一进行单因素试验。考察浸泡时间时，其他因素取中间变量值;最佳浸泡时间确定后，采用确定的条件考察超声时间，未考察因素则取中间变量值;以此类推，各设3次重复。精密称取1 g麦胚粉于100 mL具塞三角瓶中，加入蒸馏水并小幅度振荡均匀，称定三角瓶和溶液的总质量，在暗室中放置一定时间后取出。将样液放在特定温度的水中用超声波提取样品一定时间之后，擦净外壁再次称量并按先前称定的总质量补加提取溶剂。吸取溶液0．5 mL至1．5 mL离心管中，按比例加入沉淀剂氯仿，于10 000 r/min下离心15 min。吸取上清液10μL进行HPLC测定。

表2 各单因素和其变量值

1．4 对照品溶液的制备

精密称取GSH、GSSG对照品，配制浓度分别为7．72μg/mL与8．64μg/mL、15．44μg/mL与17．28 μg/mL和30．88μg/mL与34．56μg/mL的GSH∶GSSG对照品混合溶液。

1．5 色谱条件和系统适用性实验

分别在色谱柱:Synergi 4μHydro－RP 8 nm，150×4．6 mm和Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm上考查了5种流动相对GSH和GSSG分离的影响。其中流动相Ⅰ(水－乙腈)考察比例为:99∶1，98∶2，97∶3;流动相Ⅱ(辛烷磺酸钠+磷酸二氢钠混合溶液－乙腈)考察比例为:92∶8，93∶7，94∶8，95∶5，90∶10，Ⅰ和Ⅱ均用磷酸调节pH为2．5、3．0和3．5。综合考虑分离度、理论塔板数和分析时间，选择色谱柱:Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm;流速为1．0 mL·min－1;柱温25℃;进样量为10μL;流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8);检测波长为210 nm的色谱条件。此色谱条件下，理论塔板数以GSH和GSSG的峰计算均不低于4 000，如图1所示。

图1 对照品色谱图

2 结果与讨论

2．1 谷胱甘肽提取条件选择

谷胱甘肽的超声波提取条件单因素试验结果见图2。

图2 超声波提取条件的单因素试验结果

各数据均为3次重复的平均值，经显著性检验发现浸泡时间、超声时间、物料比和提取温度各变量间差异达到极显著，溶剂pH差异不显著，沉淀剂比例差异显著。单因素试验的最佳条件为:浸泡时间1 h、超声时间10 min、物料比1∶30、提取温度0℃、沉淀剂比例1∶2．0;考虑到用提取溶剂溶解样品时，溶剂pH对谷胱甘肽含量影响不大，由于小麦胚芽蛋白的等电点为pH 4．0，利于后面蛋白质的除杂，所以采用4．0作为最佳pH值。

刘国琴等［11］曾报道85℃浸提GSH得率最高。但本研究之前按其方法在60～90℃每间隔10℃提取，并用碘量法测定，发现此条件下，GSH峰与杂质峰重合使测定的GSH峰面积偏高很多。经重新建立色谱条件将两峰分离后发现，增加温度仅使杂质峰增大，而GSH峰面积基本不变。故在此温度段，增加超声温度对提高GSH的提取无显著效果，考虑到浸提与超声提取的差异，后续试验中只考察了0、25和50℃。物料比的选择上，刘国琴等［11］和卢敏等［13］分别采用了1∶9和1∶20的物料比，陈丽娜等［14］提取玉米胚中谷胱甘肽用的物料比是1∶10，而本试验中的最佳物料比为1∶30。这可能是由于刘国琴等［14］采用的是搅拌浸提，卢敏等［13］采用高压电脉冲，而陈丽娜等［14］则是对玉米胚进行先超声(时间5 s/次，超声次数30次，间隔时间5 s)后振荡的提取，提取方法和原料不同导致差异。针对浸泡时间因素，还进行了4、8、12 h的试验，超声时间进行了40 min和50 min的试验，发现谷胱甘肽含量都较低，因此后续试验未进一步考察。

2．2 色谱条件方法学考察

2．2．1 线性关系

取GSH、GSSG浓度分别为7．72、8．64μg/mL的对照品混合溶液，进样1、5、10、15、20μL，浓度分别为15．44、17．28μg/mL的对照品混合溶液，进样12．5、15、17．5、20μL，再取浓度分别为30．88、34．56μg/mL的对照品混合溶液，进样12．5、15、17．5、20μL，按“1．5”所述色谱条件测定。分别以GSH和GSSG峰面积为纵坐标，GSH和GSSG进样量(μg)为横坐标，分别绘制标准曲线，计算得到回归方程如下:

GSH的回归方程为:Y=620 490X+742

R=0．999 8

GSSG的回归方程为:Y=777 678X+110 8

R=0．999 5

以上结果表明GSH和GSSG在0．007 7～0．617 6 μg和0．008 6～0．691 2μg范围内具有良好的线性关系。

2．2．2 精密度

精密吸取GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，重复进样6次。得到GSH峰面积分别为:261 385、265 444、261 942、266 128、261 042和265 159，RSD为0．87%;GSSG峰面积分别为:332 281、333 540、332 286、327 274、326 7337和333 765，RSD为0．95%。表明进样精密度良好。

2．2．3 稳定性

据有关文献表明［4］，GSH水溶液在空气中易被氧化，可加入具有强还原性的物质如维生素C等保护其不被氧化。因此本次试验通过对对照品加VC和不加VC考察了其稳定性。分别吸取不加VC的GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，连续6 d内每天进样1次测定，结果混合标样中GSH和GSSG峰面积RSD分别为2．25%和2．58%;再分别吸取加VC的GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，连续6天内每天进样1次测定，结果混合标样中GSH和GSSG峰面积RSD分别为3．03%和0．26%。可以看出，加VC和不加VC对对照品溶液的稳定性在6 d内没影响，且具有良好的稳定性。因此，选用不加VC的对照品溶液。

2．2．4 重复性

称取供试品6份，按“1．3”制备，测得GSH含量分别为35．01、34．35、34．40、33．49、32．62和32．45 mg/100 g，平均含量为(33．72±1．03)mg/100 g，RSD为3．08%;该供试样品中未检出GSSG。

2．2．5 加样回收率

精密称取1 g样品，加入GSH和GSSG标样并按“1．3”制备后测定。GSH与GSSG各自的加入量、回收率和相对标准偏差列于表3。由表3可知，GSH在3个不同加入量下的回收率分别为94．80%、102．00%和96．09%，平均回收率为97．63%，RSD为3．93%;GSSG在3个不同加入量下的回收率平均值则分别为94．25%、102．10%和94．56%，平均回收率为96．97%，RSD为4．59%。结果表明GSH和GSSG的回收良好。

表3 GSH和GSSG的回收率

2．3 19份麦胚样品的测定

不同来源的19份小麦胚样品中谷胱甘肽含量测定结果见表4。

表4 19份小麦胚中谷胱甘肽含量/mg·(100 g)－1

测定条件:提取溶剂pH 4．0，料液比1∶30，浸泡时间1 h，在0℃下超声10 min，沉淀剂比例为1∶2．0;色谱条件为:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8);检测波长为210 nm;流速为1．0 mL·min－1;柱温为25℃。可以看出谷胱甘肽含量范围在6．58～180．71 mg·(100 g)－1;其中GSH和GSSG含量范围分别在ND(未检出)～105．46 mg·(100 g)－1和ND(未检出)～97．21 mg·(100 g)－1。据报道，小麦胚芽中谷胱甘肽含量为98～107 mg·(100 g)－1［15－16］。本研究的含量范围变幅较大，可能与材料来源有关，与生熟加工方式无必然联系。

3 结论

通过以上试验可以看出，在最适提取条件下，用Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm)，流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8)，检测波长为210 nm，流速为1．0 mL·min－1，柱温为25℃，同时测定小麦胚中GSH和GSSG，分别在0．007 7～0．617 6μg和0．008 6～0．691 2μg范围内具有良好的线性关系;进样精密度良好，重复性和稳定性高，回收良好;检测的19份不同来源麦胚样品谷胱甘肽含量差异较大。因此，此法可为麦胚中谷胱甘肽的开发利用提供一定参考依据。

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Study on Extraction and Determination Method of Glutathione from Wheat Germ

Liu Qian1Chen Li2Hu Yongjun2Ye Fengqin2Chen Qiang3
(College of Agronomy，Sichuan Agricultural University1，Wenjiang 611130)
(Yibin City Product Quality Supervision and Inspection Institute2，Yibin 644002)
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University3，Ya'an 625014)

This study is to establish the RP－HPLC method to determine the content of GSH and GSSG simultaneously．Using distilled water as solvent，the effect of the time of soak，time of ultrasonic extraction，material liquid ratio，temperature of ultrasonic extraction，solvent pH，and precipitating agent proportion on the the extracted efficiency of Glutathione were determined．The contents of glutathione were determined by using 2 chromatogram columniations and 5 mobile phases．Finally，the optimal conditions were determined．The solvent pH was 4．0，the material liquid ratio was 1∶30，the time of soak was 1 h，ultrasonic extraction 10 min in 0℃ ，and precipitating agent proportion was 1∶2．0．Chromatogram conditions were Fusion－RP column(4．60×150 mm，4μm，8 nm)at 25℃ ，the mobile phase were both a mixture of 0．08%octanesulfonic acid sodium salt and 0．24%Sodium dihydrogen phosphate in water and acetonitrile(82∶8，V/V)，adjusted to pH 2．5 with phosphoric acid．The UV detection wavelength was set at 210 nm．The flow rate was 1．0 mL·min－1．The glutathione contents from 19 wheat germs were determined．The glutathione contents had significant difference．The maximal content was 180．71 mg·(100 g)－1．

wheat germ，glutathione，extract，content

S－3

A

1003－0174(2012)10－0104－06

四川农业大学双支计划博士专项(06070401)

2012－02－02

刘千，女，1981年出生，实验师，作物遗传育种

陈黎，男，1979年出生，副教授，生物化学与分子生物学