正相超高压液相色谱法测定植物油中的维生素E

张 征 徐春祥 刘佳娣，2 许书军

正相超高压液相色谱法测定植物油中的维生素E

张 征1徐春祥1刘佳娣1，2许书军1

(江苏省产品质量监督检验研究院1，南京 210007)
(南京工业大学化学与化工学院2，南京 210009)

采用正相超高压液相色谱法测定油脂中4种常见生育酚的含量，确定一种简单、准确、快速测定维生素E的测定方法。样品经前处理后，用Zorbax RX－SIL硅胶柱分离，以乙酸乙酯－异辛烷为流动相梯度洗脱，在波长295 nm采用外标法检测α、β、γ、δ等四种生育酚在不同植物油中的含量。研究结果表明，该方法四种异构体均在8 min内出峰，线性关系在0．999 4～0．999 9间，精密度RSD＜5%，加标回收率在80%～100%，线性范围0．2～100．0μg/mL，α、β、γ、δ异构体方法检出限均在0．01μg/g左右;几种典型植物油样品验证实验表明该方法体系具有快速、准确、分离度好等特点。同时比较了调和油和精炼地沟油维生素E含量差异，初步确定α－维生素E可能作为该类地沟油识别因子。

正相超高压色谱 维生素E α－生育酚 精炼废弃油脂

维生素E，又名生育酚，是一类能够显示D－α－生育酚生物活性的衍生物的总称。天然维生素E主要有八种异构体，为α－、β－、γ－、δ－等相应生育酚和三烯酚，生育酚最为常见［1］。维生素E不但是天然的抗氧化剂，而且具有抗衰老、预防动脉硬化和心血管疾病等多种生理功能［2］。通常情况下，α－生育酚的生理活性最强，β－和γ－生育酚不及α－生育酚的一半活性，δ－生育酚几乎没有活性，而抗氧化能力则是α＜β＜γ＜δ［3］。维生素E的主要来源是植物油和胚芽油，如麦胚油、玉米胚芽油、棉籽油、花生油和芝麻油等。因此，维生素E的组成和含量可以作为食用植物油脂品质的一个重要评价指标［4］。

维生素E的分析方法包括比色法、光谱法、纸层析法、柱层析法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等［4－7］。目前，国际上通用的维生素E多采用液相色谱法［8－9］，我国现行国家标准GB/T 5009．82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》和GB 5413．9—2010《婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》以及行业标准NY/T 1598—2008《食用油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》等，都是采用液相色谱法。以上标准样品处理均采用皂化的方法提取维生素E，后采用反相液相色谱法测定含量。经文献检索，尚未见运用超高压液相色谱对维生素E的测定方法研究报导。本论文将探讨采用正相超高压色谱直接测定几种食用油中维生素E含量，建立一种食用油中维生素E快速测定方法体系，并运用该方法探讨几种食用油脂中维生素E的分布特征。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器

正己烷(分析纯)，无水乙醇、异辛烷、乙酸乙酯:色谱纯，国药集团;维生素E的四种生育酚异构体(α、β、γ、δ，单标):纯度＞98．0%，美国Sigma－Aldrich公司。

Lambda 25紫外可见分光光度计:美国PE公司;HH－2数显恒温水浴锅:国华电器有限公司;AE163电子分析天平:瑞士Mettler公司;1290超高压液相色谱－紫外检测器，其中色谱柱为zorbax RX－SIL(250 mm×4．6 mm，2．5μm):美国Agilent公司。

1．2 试验方法

1．2．1 样品溶液的配置

定制成品大豆油、葵花籽油、亚麻籽油、橄榄油、菜籽油、调和油，另外市场购买芝麻油(5种品牌)以及1个查获的地沟油样品。分别准确称取各样品2．0 g(精确至0．000 1g)，经正己烷定容至25 mL，过0．45μm微孔滤膜，用于正相色谱分析。

1．2．2 色谱条件

流动相A为纯异辛烷，流动相B为纯乙酸乙酯，采用梯度洗脱(B%):0～8 min;8－8．5 min，9→15;8．5～9 min，15→20;9～10 min，20→30，保留5 min;15～15．5 min，30→9，保留4．5 min。流 速 为1 mL/min，紫外检测波长295 nm，柱温30℃，进样量20μL。

1．2．3 标准溶液配置

精确称取α、β、γ、δ－生育酚分别100 mg，溶于正己烷并定容至100 mL，配置成1 mg/mL标准储备液(有效期2个月)。每次试验前，标准贮备液配置100μg混合标准使用液，临时配制。吸取生育酚标准使用液配置浓度分别为0．5、1、10、25、50、100 μg/mL的混标溶液。以生育酚浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并同时建立线性回归方程(表1)。

表1 维生素E的线性方程与方法检出限

2 结果与讨论

2．1 色谱条件

本试验的主要目的是研究和建立正相超高压液相色谱测定油脂中维生素含量的方法。样品经过正己烷直接抽提后，用硅胶柱zorbax RX－SIL直接分离维生素E的四种异构体。在诸多色谱条件中，流动相的选择是分析方法研发的重点。流动相中乙酸乙酯的比例对异构体保留时间有较大影响，比例为30%时，α、β、γ未能有效分离;降低至9%时，获得最佳分离效果，分离度均大于1．5，待测物质均在8分钟内出峰，因此选择该比例进行样品分析(见图1所示)。由于样品未经过固相萃取过滤，杂质较多，因此选择8 min后梯度洗脱，以减少平衡时间(具体设定见1．2．2)。

图1 流动相比例对四种生育酚的保留时间影响

2．2 线性关系与方法检出限

标准品用正己烷配置成系列溶液，在上述色谱条件下进行测定，以标准溶液的质量浓度x(μg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归，方程和相关系数见表1。相关系数在0．999 4～0．999 9之间，表明几种维生素E质量浓度在0．5～100μg/mL的范围内浓度与峰面积线性关系良好。以信噪比S/N=3计算仪器最低检测限，再根据样品的稀释倍数确定方法的检测线限，算得维生素E检测限在0．10～0．19之间。

2．3 方法的重现性、回收率与精密度

取标准溶液(100μg/mL)连续进样5次，计算峰面积之间的RSD，用来确定仪器精密度。结果显示，α、β、γ、δ的RSD分别为1．462%、0．848%、1．248%、0．805%，均小于2%，重现性良好。用芝麻油进行加标回收试验，平行5份，计算方法回收率及精密度。结果显示，在线性范围内，α、β、γ、δ的平均回收率分别为90．64%、80．19%、92．63%、95．50%，在80%～100%范围内;RSD分别为4．60%、4．28%、4．99%、4．84%，均在5%范围以内。以上显示，该方法具有良好的重现性和精密度，能够开展植物油脂中的维生素E分布特征测定研究。

2．4 样品实测结果

选取8种植物油样品用高效液相色谱法分别测定4种生育酚含量，按上述样品处理与色谱方法，测定几种油脂中的维生素E含量，结果见表2。所选样品中大豆油生育酚总含量最高，达到1．4 mg/g，橄榄油总含量最低，仅有0．2 mg/g;芝麻油中主要含有γ－生育酚，其他3种生育酚含量很低;菜籽油中主要含有α，γ－生育酚，橄榄油中主要含有α－生育酚，亚麻籽油中δ－生育酚含量很低，葵花籽油中主要含有α－生育酚，大豆油中则几乎不含β－生育酚，各单一植物油中生育酚组分含量有明显区别。比较调和油和地沟油维生素E组成发现(图2)，地沟油样品中几乎不含α－生育酚。由于α－生育酚的抗氧化能力最弱，即还原能力最弱，在地沟油精炼过程中易被转化为其他异构体形式，因此推测α－生育酚可能作为精炼地沟油的一种标示物。

表2 几种典型植物油的方法验证结果(n=3;RSD＜5%)

图2 典型油脂调和油和精炼地沟油液相色谱图

3 结论

3．1 选用zorbax RX－SIL柱正相分离生育酚，以异辛烷－乙酸乙酯为流动相，梯度洗脱，在295 nm波长下检测，获得较理想的分离效果。

3．2 运用建立的测定方法调查了几种选定食用油脂，证明方法重现性好，且各种不同食用油中生育酚各组分及总量有明显区别，可用于质量分级和营养评价。

3．3 比较调和油和精炼废弃油脂维生素E组成发现，精炼后的废弃油脂中未检出α－生育酚，该指标可能作为精炼地沟油标示物，有待进一步验证。

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Determination of Vitamin E in Edible Plant Oil by Normal Phase Ultra Performance Liquid Chromatography

Zhang Zheng1Xu Chunxiang1Liu Jiadi1，2Xu Shujun1

(Jiangsu Provincial Supervising and Testing Institute for Products Quality1，Nanjing 210007)
(College of chemistry and chemical engineering，Nanjing University of Technology2，Nanjing 210009)

A simple extraction procedure using liquid－liquid extraction coupled with normal phase ultra performance liquid chromatography(NP－UPLC)to determine four tocopherols from vegetable oils was developed．Using Zorbax RX－SIL，α，β，γ，andδtocopherols were separated by NP－UPLC within 10 min through degraded dilution conditions．The results demonstrated that the new method established in this paper had a linearity ranging from0．9994 to 0．9999．Recovery of this method changed between 80%and 100%and RSD was below 5%．Linearity range of the method for quantify vitamin E was0．2 to 100μg/mL and limitation of detection of the method was about 0．01μg/g．The assay was successfully applied to the analysis of several oil samples and find there significant difference inα －tocopherols content between regulatory oil and refined waster oil．We proposedα－tocopherols as a biomarker for distinguishing waster oil and the further study was undertaken．

NP －UPLC，vitamin E，α － tocopherol，refined waster oil

O657．7

A

1003－0174(2012)10－0109－04

时间:2012－08－29 10:25

网络出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120829．1025．002．html

国家质检总局资助项目(2009QK146)

2012－03－27

张征，男，1972年出生，高级工程师，食品安全与质量监管

许书军，男，1977年出生，高级工程师，食品化学与营养评价