ELISA一步法和二步法检测HBsAg及NAT检测HBV-DNA结果分析

王旭菲 熊丽红 黄丽红

（1 江西省妇幼保健院，江西 南昌 330008；2 江西省血液中心，江西 南昌 330077）

ELISA试剂盒从操作方法和反应原理上区分有两种：一步法和二步法，由于一步法少了1次洗板及孵育过程，节省了时间，得到广泛应用。但在实际工作中发现ELISA一步法钩状效应明显[1-3]，易造成漏检现象。卫生部要求自2010年10月1日起执行《中华人民共和国药典（2010年版）》后，试剂模式变更为二步法。2011年3月本中心ELISA检测全由一步法改为二步法。现结合NAT（核酸）检测HBV-DNA结果将ELISA检测HBsAg由一步法改二步法结果比较报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源

本血液中心2010年9月至2011年2月无偿献血者血液标本33483人份（采用2种试剂厂家ELISA一步法检测和NAT检测）；2011年4月至9月无偿献血者血液标本35064人份（采用2种试剂厂家ELISA二步法检测和NAT检测）。献血者体检均符合卫生部《献血者健康检查要求》，并经硫酸铜比重法筛查血红蛋白、乙型肝炎金标试纸条筛查HBsAg均合格后抽取血样，分离血浆备用。ELISA检测用EDTA-K2抗凝国产试管，NAT检测用美国BD公司带分离胶试管。

1.2 试剂与仪器

HBsAg ELISA试剂盒为试剂A（北京金豪生物制品有限公司，HBV-JH）和试剂B（厦门新创生物制品有限公司，HBV-XC），NAT检测试剂为cobas TaqScreen MPX HBV/HCV/HIV联合检测试剂（美国罗氏诊断公司定性检测试剂）。HIMILTON STAR加样仪（瑞士哈美顿公司）；FAME全自动酶免分析仪（瑞士哈美顿公司）；核酸检测平台（美国罗氏诊断公司）：HIMILTON STAR IVD标本混样仪（瑞士哈美顿公司），cobas AmpliPrep核酸提取仪与cobas TaqMan分析仪通过混样和数据管理服务器（PDM）连接组成平台（简称CAP/CTM）。

1.3 方法

1.3.1 ELISA方法

将抗凝血液标本室温离心后，用HIMILTON STAR加样仪自动加样，FAME全自动酶免分析仪检测，过程严格按照试剂盒说明书操作，结果以吸光度值＞80% CUT-OFF值判定为阳性。

1.3.2 NAT方法

2种厂家ELISA试剂检测HBsAg均阳性不做核酸检测。核酸定性检测采用cobas TaqScreen MPX方法，按试剂说明书HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA-1最低检测限95%可信度分别是3.7IU/mL、10.7IU/mL、49IU/mL。

1.3.2.1 混样检测每6份标本各取166.7μL血浆汇集成1份1mL混样标本，在cobass 201平台使用cobas TaqScreen MPX试剂进行检测，如果6份标本组成的pool检测结果为非反应性，则该批标本检测完成；如果pool检测结果为反应性，则将组成pool的6份标本进行拆分单检。

1.3.2.2 拆分单检对组成pool的6份标本进行单个检测，每个标本取1mL血浆在cobass 201平台进行NAT，如某1个/若干个标本单检结果为反应性，则进一步进行核酸鉴别检测；如单检结果为非反应性，则将原pool的反应性结果视为假阳性，即6个标本均为核酸检测无反应性。

1.3.2.3 质量控制按照cobas TaqScreen MPX test试剂盒说明书中步骤检测。每组试验均设置1个阴性对照和5个阳性对照，要求阴性对照没有扩增信号，阳性对照检测值均在相应的范围内，任何1个对照不符，本轮试验结果无效。对于每个标本，按照说明书描述的结果判定原则报告检测结果如下：①标本检测结果为阳性时，无论内参检测结果是阴性还是阳性，标本检测结果均报告为阳性；②标本检测结果为阴性时分2种情况：内参检测结果为阳性，标本检测结果报告为阴性；内参检测结果为阴性，该标本本次实验无效，需要重试。

1.4 统计学分析

采用STATA7.0对数据进行统计学分析，使用卡方检验方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

表1 ELISA一步法和二步法检测结果比较

2.1 ELISA一步法和二步法检测结果比较，见表1。结果显示一步法与二步法检测结果有明显的统计学差异，二步法阳性率明显高于一步法。

2.2 同种试剂厂家一步法和二步法检测结果比较，见表2。HBV-JH及HBV-XC 2种厂家试剂二步法阳性率均明显高于一步法。

表2 同种试剂厂家一步法和二步法检测结果比较

表3 一步法和二步法2种不同试剂厂家结果比较

2.3 一步法和二步法2种不同试剂厂家结果比较，见表3。结果显示北京金豪和厦门新创2种试剂厂家一步法，检测结果无明显差异；二步法有明显差异，提示2种试剂厂家由一步法改二步法后检测结果不相符现象明显。

2.4 一步法和二步法双试剂阳性结果比较，见表4。结果提示二步法双试剂阳性率明显高于一步法。

表4 一步法和二步法双试剂阳性结果比较

2.5 同种试剂厂家一步法和二步法单一试剂阳性（即单独一种试剂厂家检测出阳性）结果比较，见表5。结果提示，北京金豪和厦门新创两试剂厂家一步法和二步法单试剂阳性均有统计学差异，不过北京金豪由一步法改二步法后单试剂阳性越来越高，厦门新创由一步法改二步法后单试剂阳性越来越低。

表5 同种试剂厂家一步法和二步法单一试剂阳性结果比较

2.6 通过ELISA剔除双试剂阳性标本后进行NAT检测，由一步法改二步法后NAT阳性结

果比较，见表6。经二步法剔除双试剂阳性标本后进行NAT检测阳性率明显低于一步法剔除双试剂阳性标本的NAT阳性率。

表6 一步法和二步法剔除双试剂阳性后NAT结果比较

3 讨 论

目前，对ELISA一步法和二步法结果比较已有不少报道，但都有针对性，有的考虑溶血单因素影响[4,5]，有的主要考虑钩状效应的研究[6,7]，均未纳入大批量标本的检测，缺乏综合性分析。本研究综合分析33483份经一步法检测和35064份经二步法检测，并对非双试剂阳性的标本进行NAT检测后结果进行了分析比较。

我们通过统计2010年9月至2011年2月无偿献血者血液标本33483人份（采用ELISA一步法和NAT检测）和2011年4月至9月无偿献血者血液标本35064人份（采用ELISA二步法和NAT检测）结果，提示二步法阳性率明显高于一步法，通过NAT检测发现单试剂阳性95%均为假阳性；一步法2种试剂厂家检测结果无明显差异，改二步法后2种试剂厂家检测结果出现明显差异提示在试剂方法改变过程中不同厂家试剂质量出现了较大差异。

经二步法剔除双试剂阳性标本后进行NAT检测阳性率明显低于一步法剔除双试剂阳性标本后的NAT阳性率，提示HBsAg漏检得到一定控制，ELISA由一步法改为二步法后进一步减少了经输血传播乙型肝炎病毒的发生。

研究表明ELISA一步法钩状效应明显[1-3]，HBsAg＞2.6×105ng/mL时即可能产生钩状效应[8]。通过卫生部反馈本中心NAT阳性标本HBsAg定量检测结果发现，2010年9月至2011年2月和2011年4月至9月见均未发现可能引起钩状效应的高浓度HBsAg标本，可能由于无偿献血者献血前经过体检咨询和ALT、HBsAg快速初筛，基本由健康人群中采集血液。

为保证临床用血安全尽量避免HBsAg的漏检是大家追求的共同目标，国家也积极推广核酸检测，不过最大限度降低由假阳性反应导致的血液不合理淘汰和资源浪费也是应该考虑的因素，这就要求各试剂厂家在强调ELISA血液筛查试剂检测灵敏度的同时，积极改善其检测特异性，减少假阳性避免血液不必要浪费。

[1]赖雄,吴兆勇,余岸松.高含量HBsAg致ELISA一步法假阴性的探讨[J].吉林医学,2007,28(7):879-880.

[2]冯健亮,陆典瑞,李启辉.抗HIV(1/2)ELISA一步法检测时应注意钩状效应[J].中国输血杂志,2003,16(4):265-266.

[3]张京豫,谭爱国,郭健.TP-ELISA一步法检测梅毒螺旋体抗体钩状现象研究[J].中国实验诊断学,2007,11(11):1520-1523.

[4]薛俊太,邓翠华,王惟等.溶血标本在EL ISA 一步法和二步法中对HBVM测定结果的影响[J].检验医学与临床,2009,6(14):1126-1127.

[5]马良艳,王秋实,王殿昌.ELISA一步法与二步法在HBsAg检测的应用比较[J].中国医学工程,2011,19(10):92-93.

[6]张文利,刘月芳.ELISA一步法与二步法及放免法对HBsAg检测结果分析[J].中国公共卫生,2000,16(8):756.

[7]顾志冬,吴倩文,冯晓静,等.用于国产一步法HBsAg ELISA试剂及确认试验试剂的改进方法[J].检验医学,2011,26(1):32-35.

[8]陈远林,秦立新,张仁生.ELISA一步法HBeAg阳性HBsAg 阴性标本的分析[J].临床检验杂志,2004,2(1):45.