急性胰腺炎时腺泡细胞凋亡与Bax表达*

谢荣俊 张树友 李峰 周筱筠 刘龙飞 卢先州

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常见的外科急腹症，其发病机制尚未完全阐明。最近发现，胰腺腺泡细胞凋亡与AP的发生、发展及转归密切相关，使之成为当前的研究热点。Bax是广受关注的凋亡相关基因，可促进细胞的凋亡，但目前国内外关于Bax与AP时腺泡细胞凋亡的研究鲜有报道。本研究旨在探讨AP时腺泡细胞凋亡与Bax表达的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SD大鼠30只(南华大学动物实验中心)，雌雄不拘，体重(280±20)g，购回后适应性喂养1周。抽签法随机分为假手术组(A组)，急性水肿性胰腺炎组(B组)，急性出血坏死性胰腺炎组(C组)，每组10只。

1.2 实验试剂与器材 牛磺胆酸钠(北京丰特斯化工材料有限公司)；淀粉酶测试盒(南京建成生物工程研究所)；DNA原位末端标记凋亡检测试剂盒，Bax兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)；微量泵(OLYMPUS公司)；创面封闭胶(广州香雪生物医学工程有限公司)。

1.3 动物模型制备 对逆行胰胆管穿刺注射法加以改进[1]：术前大鼠禁食12 h，自由饮水。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。麻醉满意后固定于手术台，术野备皮，络合碘消毒，铺无菌孔巾。取上腹部正中切口进腹。显露、提取十二指肠，辨认胰胆管及肝门部胆总管。顺胰胆管走行观察乳头开口位置，在其开口略偏下的系膜缘肠壁上选取一无血管区，用5号注射器针头戳一小孔，置入预先处理过的硬膜外导管(直径0.8 mm)。导管前端贴系膜缘肠壁向乳头开口方向缓慢滑行，探入胰胆管内。将导管推进5 mm后，于胰胆管末端外放置一木质短棒(无菌棉签棒自制)，用小圆针、1号线将胰胆管下段及其内的硬膜外导管一并缝合，确认导管通畅后，打结于木棒上，同法缝扎关闭肝门部胆总管。导管末端接输液转换器，用微量泵逆行泵入0.5%(B组)或5%(C组)的牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g，0.2 ml/min)。药物泵入5 min后即可见胰胆管、主胰管扩张，胰腺组织水肿、充血(见图1)，C组改变较B组严重。维持10 min后剪线，移除木棒，退出导管，用创面封闭胶封闭穿刺孔。将十二指肠复位，分层关腹。A组进腹后，仅翻动十二指肠、胰腺，不穿刺注药。三组大鼠关腹后均于大腿外侧皮下补液(生理盐水2 ml/100 g)，苏醒后禁食，自由饮水。

1.4 标本采集与观测指标 术后12 h再次剖腹。肉眼观察胰腺大体病理改变，根据Hughes标准[2]进行评分。观察腹水颜色，收集腹水并计量。抽取下腔静脉血检测血清淀粉酶活性。采血后切取胰腺组织，10%福尔马林固定，制作石蜡标本切片观察。标本采集后断颈法处死大鼠。

图1 注药后5 min，胰胆管扩张，胰腺水肿、充血

图2 B组术后12 h胰腺轮廓较清楚，广泛水肿，局部可见皂化斑

图3 C组术后12 h胰腺轮廓消失，出血坏死严重，可见暗黑色坏死灶

图4 C组术后12 h肠系膜处可见大量皂化斑

图5 B组TUNEL法染色见大量腺泡细胞凋亡(400倍)

图6 C组TUNEL法染色见少量腺泡细胞凋亡(400倍)

图7 B组免疫组化染色Bax重度阳性(400倍)

图8 C组免疫组化染色Bax轻度阳性(400倍)

1.4.1 HE染色与镜下病理评分 切片后行HE染色，100倍镜下观察，根据Schmidt标准[3]评分。

1.4.2 DNA原位末端标记法(TUNEL法) 按试剂盒说明操作，腺泡细胞胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。每张切片在400倍镜下随机选取5个视野，计算凋亡细胞数和总细胞数，凋亡指数(AI)＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4.3 免疫组化SABC法 按试剂盒说明操作，Bax染色的阳性反应为腺泡细胞的胞膜、胞浆中出现棕黄色颗粒。每张切片在400倍镜下随机选取5个视野，根据阳性细胞数占视野中总细胞数的比例不同分为4级：阴性：阳性细胞数<10%;轻度阳性：阳性细胞数11%～25%;中度阳性：阳性细胞数26%～50%;重度阳性：阳性细胞数>50%。

1.5 统计学处理 使用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以()表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；等级资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验；相关性分析采用直线相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清淀粉酶活性与腹水量见表1。

表1 三组大鼠术后12 h各观测指标比较

2.2 大体病理改变及评分 A组：胰腺正常，腹腔内无腹水与皂化斑。B组：胰腺轮廓较清楚，广泛水肿，偶见点状出血，未见明显坏死，腹腔内有少、中量清亮腹水，可见点状皂化斑(见图2)。C组：胰腺轮廓消失，出血坏死严重，可见暗黑色坏死灶，腹腔内有大量血性腹水，胰腺、胰周及肠系膜等处可见大量皂化斑(见图3、图4)。大体病理评分见表1，病变愈重，分值愈高。

2.3 镜下病理改变及评分 A组：除部分腺泡细胞水肿外，基本正常。B组：腺泡细胞水肿明显，无坏死，有炎症细胞浸润，间质水肿，小叶间可见炎性渗出，叶间隙略增宽，偶见微血管破裂伴红细胞溢出。C组：腺泡细胞肿胀明显，呈片状坏死，伴大量炎症细胞浸润，小叶结构紊乱，其间充斥着大量炎性渗出，叶间隙明显增宽，间质内微血管破裂，大量红细胞溢出。镜下病理评分见表1，病变愈重，分值愈高。

2.4 腺泡细胞凋亡情况与AI见表1，图5、图6。

2.5 腺泡细胞Bax的表达情况见表1，图7、图8。

2.6 腺泡细胞凋亡与胰腺病变严重程度的相关性分析 直线相关分析显示：B、C组中腺泡细胞AI与大体病理评分(B组：r=-0.761，P<0.05；C 组：r=-0.780，P<0.05)及镜下病理评分 (B组：r=-0.763，P<0.05；C 组：r=-0.664，P<0.05)均呈显著负相关。

3 讨论

临床上大多数AP患者病因明确(胆石或酒精因素)，但相同的致病因素作用于不同个体时，胰腺病变的严重程度以及临床表现和预后却不尽相同随着分子生物学技术的发展，人们从细胞水平对AP进行了详尽的研究[4-7]，结果表明，AP发生时，最早的病理变化出现在胰腺的腺泡细胞内，腺泡细胞本身对损伤的反应，即细胞的死亡方式(坏死或凋亡)，是决定病变严重程度以及后续病理过程发生、发展的关键。如果腺泡细胞以坏死的方式死亡，将伴随剧烈的炎症反应，易产生瀑布样级联效应，使病情凶险，并向重型发展；但若以凋亡的方式死亡，则伴随的炎症反应轻微，病情向轻型发展。

笔者成功建立了大鼠急性水肿性与出血坏死性胰腺炎模型，发现B、C组在血清淀粉酶活性、腹水量、大体以及镜下病理评分等方面均存在显著性差异。采用TUNEL法检测腺泡细胞的凋亡情况发现，B组AI显著高于C组，直线相关分析发现，两组AI与大体及镜下病理评分等反映胰腺病变严重程度的指标均呈显著负相关关系，AI高者，胰腺病变较轻，反之则较重。因此笔者认为，AP时腺泡细胞的凋亡是机体的一种自我保护机制。

Bax作为Bcl-2家族成员之一[8]，主要通过改变线粒体外膜的通透性，调节促凋亡因子的释放来调控细胞的凋亡[9]。通过实验发现，C组Bax的阳性率显著低于B组，两组间Bax的表达以及腺泡细胞AI均存在显著差异。据此推测，两组大鼠在血清淀粉酶活性、腹水量、大体及镜下病理评分之间的区别可能是由于组间Bax的差异性表达导致腺泡细胞的凋亡不等所致，提示Bax参与了AP时腺泡细胞凋亡的调控。

[1]谢荣俊，张树友，费书珂，等.大鼠重症急性胰腺炎模型制备方法的探讨与改进[J].中国医药导报，2007，11(04Z)：22-24.

[2]Hughes C B，Grewal H P，Gaber L W，et al.Anti-TNFalpha therapy improves survival and ameliorates the pathophysiologic sequelae in acute pancreatitis in the rat[J].Am J Surg，1996，171(2)：274-280.

[3]Schmidt J，Rattner D W，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann Surg，1992，215(1)：44-56.

[4]Kaiser A M，Saluja A K，Sengupta A，et al.Relationship between severity，necrosis，and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis[J].Am J Physiol，1995，269(5)：C1295-1304.

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[6]Bhatia M.Apoptosis of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis：is it good or bad[J].J Cell Mol Med，2004，8(3)：402-409.

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[8]刘珊珊，李蒙，李钰.Bcl-2家族蛋白相互作用因子的研究进展[J].国外医学(遗传学分册)，2005，28(6)：336-338.

[9]范志宁，刘训良.细胞凋亡与急性胰腺炎关系的研究进展[J].胰腺病学，2006，6(3)：184-186.