介绍一种改良的伊红染色液

田玉旺 朱红艳 朱培双 邢 宜

（北京军区总医院病理科，北京100700）

在常规HE染色过程中，要求切片核浆对比要分明，细胞浆染色质量的好坏亦至关重要。伊红是细胞浆常用的染色剂，其配制方法较多，多用水溶性伊红染色液，在染色过程中发现水溶性伊红染色液易出现着色过淡、核浆共染及染色后的切片置一段时间后易褪色等现象，给观察切片的组织形态带来一定困难。我们根据伊红的化学性质和染色理论，结合实际应用情况，对传统伊红染液的配制方法进行了一些改良，收到了理想的染色效果。

材料和方法

1.标本

选取我院临床送检的活检组织，包括食管、阑尾和子宫肌瘤各20例，均采用10%中性福尔马林固定，常规组织脱水、透明、浸蜡和包埋。所有组织统一切片，每块组织各切片2张，分成两组，一组用水溶性伊红染液进行染色，另一组采用改良的伊红染液进行染色。

2.传统水溶性伊红染液的配制方法

1g伊红Y，蒸馏水200ml，充分混溶后加冰醋酸1滴。

3.改良的伊红染色液配制方法

1%荧光桃红B水溶液10ml，1%伊红Y水溶液100ml，780ml 95%乙醇，4ml冰醋酸，充分混合溶解后即可使用。

4.染色方法

两组切片同时用二甲苯脱蜡至自来水，苏木素染色6min，自来水洗，1%盐酸酒精分化数秒钟，自来水洗，0.5%氨水返蓝20s，水洗后入伊红染液。第一组入水溶性伊红染液染色1min，第二组入改良的伊红染液染色1min，两组同时水稍洗后入80%乙醇1－2s，95%乙醇、无水乙醇I、II各1－2min，二甲苯I、II透明各3－5min，中性树胶封固。

结 果

传统水溶性伊红染液染色：细胞浆、肌纤维、胶原纤维等染色不够鲜艳，红色偏淡（图1），切片染色后很容易褪色，且染液使用时间较短。

改良的伊红染色液染色：伊红着色能力强，色泽鲜艳，细胞浆和其他组织成分呈现出深浅不一的红色，肌纤维呈鲜红色，胶原纤维呈粉红色（图2）。

图1 食管组织：伊红染色淡。水溶性伊红染色×100图2 食管组织：伊红染色鲜艳。改良的伊红染色×100Fig.1 Esophageal tissue：Eosin staining light.Water soluble eosin stain×100Fig.2 Esophageal tissue：Eosin staining bright red.Modified eosin stain×100

讨 论

伊红Y的化学名称为四溴荧光素二钠盐，含有一个醌型苯环的发色基和两个形成钠盐的酸性助色基。其溶于水中就能离解成带负电荷的色酸部分（即染料的有色部分）和带正电荷的钠离子部分（即染料的无色部分）。伊红染液为弱酸性，组织细胞的化学成分从染液中获得氢离子而成为带正电荷的离子，继而与带负电荷的阴离子色酸部分相结合达到染色效果［1］。伊红在显示细胞浆、嗜酸性颗粒、肌纤维和胶原纤维等时，具有很强的亲和力，呈现出不同色调的红色，它是最适合与苏木素相结合用以显示组织结构的染料。

在常规HE染色过程中，多用水溶性配制的伊红Y染色液对组织进行染色，我们在实际应用过程中发现，这些水溶性伊红染色液配制方法简便，但普遍存在对细胞质的着色力较弱，特别是对肌纤维、胶原纤维、细胞浆等染色不够鲜艳，颜色偏淡。在水洗、分化和脱水过程中较易褪色，染液的使用有效期较短，应用一段时间后染液有沉淀产生，染色效果明显下降，核浆对比不明显。

近年来，许多单位使用沉淀的酸化伊红染液，该配方中加入了醋酸或盐酸，其目的是造成染液比细胞质等电点（PI＝4.7－5.0）更为酸性的环境，细胞质发生碱式电离，带正电，因而与带负电荷的阴离子色酸部分相结合而达到染色效果。但我们发现该染液p H值低于细胞核染色质等电点（PI＝3.3），使细胞核染色质也发生碱式电离，带有正电而被酸性染料染成红色，从而导致出现核浆共染现象。另外由于伊红染液的酸性增强，致使其着色速度增快，染色时不易控制，易出现细胞浆着色过深现象，同时对已染上的苏木素有褪色作用，导致组织切片核浆对比不鲜明。

本文经大量实验，对传统的伊红染液配方进行了改良，即在伊红Y染液中加入适量的荧光桃红B染液，组成伊红Y和荧光桃红B混合染色液，这样可以更明确地显示不同的组织成分，肌组织和胶原纤维将很容易区别，红细胞的颜色会更加明亮。荧光桃红B又称焰红B，为一种砖红色粉末［2］，伊红Y溶液中加入适量荧光桃红B溶液后，能使细胞质的色泽更为鲜艳，对肌纤维和胶原纤维具有很强的亲和力，增强了与细胞核的对比度。应用中发现改良的伊红染色液，染色力明显增强，使色泽更加鲜艳，染色稳定，红蓝相映，核浆对比明显，细胞核呈蓝色，细胞浆和其他组织成分呈现出深浅不一的红色，尤其对肌纤维、纤维结缔组织和胞浆内嗜酸性颗粒着色鲜艳，相比之下单纯性水溶性伊红液细胞质着色较慢，颜色也偏淡。

在配制伊红染液中，我们均加入适量的冰醋酸，其目的是为了增强组织细胞的染色力。伊红是一种酸性红色细胞浆染料，由于钠离子的存在而呈碱性状态，冰醋酸与钠离子结合后使溶液呈酸性带负电，而易与带正电的细胞浆结合。细胞浆的等电点为p H4.7－5.0，在伊红染液中加入冰醋酸就是把p H值调到细胞浆等电点p H4.7以下使细胞浆发生碱式电离带正电，易与带负电的酸性染料伊红结合在一起。但我们必须严格控制好加入冰醋酸的量，不加或加入少量冰醋酸，伊红只能通过渗透或弥散作用很难染色，而且和组织结合也不牢固，分化后易褪色；加入过量冰醋酸，使p H值变得太低，使染色体等电点到p H＝3.3以下，一方面使染色体也发生碱式电离带正电也被酸性染料染色，造成核、质对比不清；另一方面抑制了伊红电离，形成水溶性伊红Y沉淀，导致染色液失效；另外易引起色调不正，切片特别容易褪色，染色结果不能长期保存。因此染液的p H应调到小于细胞浆等电点，而大于细胞核等电点时，染片效果最好。

伊红染色应以苏木素对细胞核染色程度为标准，以求达到对比鲜艳清晰，层次清楚。伊红染色时间与染液的新旧，所染组织切片的厚薄，组织的新鲜与陈旧以及经乙醇分化调色和乙醇浓度有关。在染液使用过程中，可采用肉眼观察来控制切片着色深浅，显微镜下观察切片染色效果，及时了解染液使用情况。细胞核过淡而细胞浆过浓或细胞浆过淡而细胞核过浓均影响对组织切片的观察。伊红染色程度应以对比色彩相适应为佳。

［1］龚志锦，詹镕洲.病理组织制片盒染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994，50－51

［2］王伯沄，李玉松，黄高昇等。病理学技术.北京：人民卫生出版社，2000，1066－1067