酸性伊红粉剂的制备及在HE染色中的应用

李杏娟

（南京明基医院病理科 江苏 南京 210019）

伊红又名曙红，为砖红色粉末状或酱红色结晶，是病理学实验室中HE染色最常用的胞浆染料。曙红本身溶于醇而不溶于水，也称醇溶性伊红，而它的钠盐、钾盐或铵盐可溶于水，因此称为水溶性伊红。在常规工作中伊红染料虽然配方较多，但是在操作及染色效果方面不够理想，常需加入冰醋酸，但加入剂量不易掌握，量少达不到促染作用，加入过多染液易沉淀，且引起色调不正，特别是容易褪色，染色结果不能长期保存。为了更好的增强染色效果和提高工作效率，笔者用了一整瓶（25g）醇溶性伊红Y和10ml盐酸等，一次性配制成酸性伊红粉剂贮存。此粉剂性质稳定，后续使用时简便易操作，所配制的伊红染液着色力强且持久，所染切片颜色亮丽、不易褪色，后期易长期保存。现将酸化伊红粉剂的制备方法及应用体会介绍如下：

1.资料与方法

A：醇溶性伊红Y 25g（图1），蒸馏水500ml，盐酸10ml。60℃温箱，1000毫升三角烧瓶或烧杯一个，漏斗一个，玻璃棒一根，大号滤纸一张。

图 1 醇溶性伊红 Y 25g

图 2 蒸馏水 500ml+ 醇溶性伊红Y25g，搅拌溶解。

图 3 伊红溶解后 + 盐酸 10ml，静置过夜。

图 4 过滤。

图 5 多次洗涤，再过滤。

B：在1000毫升三角烧瓶或烧杯中依次加入醇溶性伊红Y 25g和蒸馏水500ml，搅拌溶解（图2）；再加入盐酸10ml，继续充分搅拌溶解，之后静置过夜（图3）。次日用大号滤纸过滤，留滤纸上的沉淀，弃滤液（图4）。用蒸馏水洗涤滤纸上的沉淀，过滤3到4次，弃滤液（图5）。然后将沉淀物连同滤纸一起放入60℃烤箱内烘干。最后将干燥的伊红粉末放置瓶中保存，此即为酸化伊红粉剂。

C：使用时取其粉末0.5g，加95%乙醇500ml溶解即可。

2.结果

染色时间10～20秒，伊红所染细胞及组织颜色亮丽，呈现出不同程度的红色或粉红色，与苏木素所染的蓝色细胞核对比明显、清晰、层次分明。

3.分析讨论

细胞质内构成蛋白质的氨基酸种类很多，他们有不同的酸碱度。当胞质的PH值调到它的等定点范围，即PH4.7～5.0时，胞质呈现兼性离子（以蛋白质为主），对外不显电性，此时酸性染料和碱性染料都很难使胞质染色，而调节其酸碱度可影响染色反应。在染液中加入一定量的盐酸后把PH值调到了胞质等电点以下，即PH值小于4.7，这样抑制了胞质的酸式电离，呈现出碱式电离，使胞质带正电荷，易被带负电荷（阴离子）的酸性染料染色。

伊红Y（四溴荧光素二钠盐，分子式C20-H6O5Br4NO2）。一方面，其中的羟基（-OH）和羧基（-COOH）为酸性助色团，与碱作用生成盐，其水溶液电离后生成的有色离子为阴离子，易与带正电荷（阳离子）的氨基结合使胞质着色。胞质中的蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸性粒细胞颗粒、肌肉和结缔组织等被染成不同程度的红色或粉红色（图6-10）。另一方面，室温下，伊红Y在水中的溶解度远远大于在酒精中的溶解度，它在溶液反应中，由于钠离子的存在而成碱性状态。而加入盐酸后，即伊红在酸化处理过程中，去除了染料中对染色有影响的金属钠离子和杂质，起到了促染的作用，这样增加了染液与组织之间的亲和力，从而增强了染液的染色能力，使染液具有着色快，分化不易褪色，颜色亮丽，与苏木素所染的蓝色细胞核对比突出。

图 6 （HE×100）

图 7 （HE×100）

图 8 （HE×100）

图 9 （HE×100）

图 10 （HE×100）

4.小结

在病理技术常规HE染色中，以往用伊红染液染色时，不仅染色时间长，而且在后续脱水过程中易褪色，使胞浆着色不理想，后续切片不利于保存。而预先配制好的酸性伊红粉剂，性质稳定，可长期保存而不影响试剂质量，随时可以称取配制，现配现用，配制方法简便易操作，染液着色力强且持久，在缩短染色时间的同时，之后的水洗和酒精脱水也不易褪色，且组织着色鲜艳，细胞浆、肌肉、纤维及红细胞等色彩分明。既达到了染色目的，又使染色效果更好，染色后的切片也能长期保存而不褪色。在常规HE染色实践中，1g酸化伊红粉剂配制的染液可染HE切片约3000张，与其他伊红染液相比，不仅操作简单、提高染色质量、节省开支，而且缩短染色时间、省时省力。提高染色质量的同时，也提高了工作效率。