生长休止蛋白7在成年大鼠肾脏、心脏和肝脏中的差异表达

侯良芹 丁艳霞 熊克仁

（皖南医学院人体解剖学教研室，芜湖241000）

生 长 休 止 蛋 白 （growth－arrest－specific protein 7，Gas7）是Gas基因家族中的一员，于1998年从小鼠无血清培养的成纤维细胞中首次被分离出来，主要表达于神经组织，如小脑、大脑皮质和海马等，特异高表达于小脑的浦肯野细胞［1，2］，参与神经系统的发育，尤其是神经元突起形成和延伸的调控［3，4］。但Gas7在其它器官和组织的表达和功能研究资料甚少［5］，在肾脏、心脏和肝脏这三个重要脏器的表达和功能国内外未见报道。本研究用RT－PCR和免疫组织化学方法观察了Gas7基因m RNA和蛋白在成年SD大鼠肾脏、心脏和肝脏的表达分布，为进一步研究Gas7的生理功能提供参考资料。

材料和方法

1.实验动物及主要试剂

健康成年SD大鼠16只，雌雄不拘，体重250g左右，清洁级，购自南京青龙山动物中心，合格证号为SCXK（苏）2009－0001。8只用于 RT－PCR实验，8只用于免疫组化实验。

山羊抗Gas7抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记的兔抗山羊二抗，DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol溶液（Ta KaRa公司）；Agarose－1000，Taq DNA Polymerase（Invitrogen，USA）。大鼠Gas7和β－actin引物由上海捷锐生物工程公司合成。

2.RT－PCR方法检测大鼠肾脏、心脏和肝脏Gas7 mRNA的表达

大鼠直接断头处死，取其肾脏、心脏和肝脏组织0.1g，加入1ml Trizol溶液裂解，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。用紫外分光光度计测RNA的浓度后。取1μg的总RNA逆转录合成cDNA待用。Gas7扩增的目的片段为492bp，其上游引物为5＇－AAG AAG AGT CTG GCC GAT GA－3＇，下游引物：5＇－CTC GAC TGT GCT TTG GTT GA－3＇。βactin作为内参，扩增片段为282bp，上游引物：5＇－CAG GCA CCA GGG CGT－3＇，下游引物：5＇－ATG GCT GGG GTG TTG AAG－3＇。PCR 的 条 件 为，95℃3min预变性，后接32个循环（β－actin 28个循环），每一次循环的条件是：94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s。取扩增产物5μl，1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照，测光密度值（OD值），并进行分析。m RNA相对表达＝样品OD值／β－actin OD值。

3.免疫组织化学方法检测Gas7蛋白在大鼠肾脏、心脏和肝脏的表达

大鼠用50mg／kg戊巴比妥钠（浓度为0.35%）深度麻醉后，经左心室先快速（10ml／min）输入150ml 0.9%生理盐水，接着缓慢滴注含1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的0.1mol／L磷酸缓冲液，进行灌注固定，结束后取出肾脏、心脏和肝脏组织放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定12h，常规梯度酒精、二甲苯脱水、透明，石蜡包埋，连续冠状切片，片厚5μm，60℃烤片1h，备用。

组织切片脱蜡入水后，放0.01mol／L枸橼酸缓冲液（p H 6.0）中微波抗原修复；滴加3%H2O210min灭活内源性过氧化物酶；5%BSA 37℃封闭30min；滴加山羊抗Gas7抗体稀释液中（1∶100），4℃冰箱过夜；用0.02mol／L PBS（p H 7.4）洗5min×3次，滴加HRP标记的兔抗山羊二抗（1∶200），37℃孵育30min；0.02 mol／L PBS洗5min×3次，DAB显色5 min；部分切片用苏木素复染；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍摄照片。本实验中，用PBS代替一抗作为阴性对照。

采用图像分析系统对图片进行分析。每只大鼠肾脏、心脏和肝脏各取2张能够反映各脏器Gas7表达水平的具有代表性的切片，每张切片测2个单位面积Gas7免疫阳性产物的平均灰度值。

4.统计学处理

结 果

1.RT－PCR检测大鼠肾脏、心脏和肝脏Gas7 mRNA的表达

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图像（图1）显示，肾脏、心脏和肝脏的内参β－actin表达稳定。Gas7 mRNA在肾脏的表达丰富，在心脏的表达明显弱于肾脏（P＜0.05），而在肝脏组织，条带很模糊，基本看不清，Gas7 mRNA的表达很弱。Gas7 mRNA在大鼠肾脏、心脏和肝脏表达的半定量分析结果见图2。

2.免疫组织化学方法检测Gas7蛋白在大鼠肾脏、心脏和肝脏的组织细胞学分布

Gas7免疫阳性产物呈棕黄色。在用PBS作为阴性对照的肾脏组织切片上未见阳性反应，说明本实验的结果具有特异性（图3F）。

在肾脏组织，4×10低倍镜视野下（图3A），Gas7免疫阳性产物特异性地表达于肾皮质和肾髓质交界处的肾小管，显示较深，呈棕褐色。10×10低倍镜下（图3B），可见Gas7免疫阳性的肾小管与周围没有着色的肾小管境界很清晰，管腔形态不太规则。在苏木素复染的4×100高倍镜视野下（图3C），Gas7免疫强阳性的肾小管管壁较厚，上皮细胞呈锥体型，细胞之间境界不清，根据位置和形态，可以确定高表达Gas7蛋白的是近髓肾单位的近曲小管，Gas7免疫阳性产物位于上皮细胞的基底侧膜；髓质处的集合管有较弱的Gas7蛋白表达。而管腔较大，管壁较薄的远曲小管没有着色；境界清晰的肾小球处也没有Gas7免疫阳性产物。

肝脏组织未见明显的Gas7免疫阳性反应（图3D）；在心脏（图3E），在心肌纤维的纵切面上，Gas7免疫阳性产物分布于心肌纤维的肌质和肌膜，在心肌纤维横切面上，Gas7免疫阳性产物呈点状主要分布于心肌纤维的周边部分。Gas7在心脏呈中等强度显色，弱于肾脏组织（P＜0.05）。肾脏、心脏和肝 脏Gas7免疫阳性产物平均灰度值的比较见图4。

讨 论

Gas7基因在大鼠肾脏、心脏和肝脏的表达到目前为止未见报道。本文首次观察到Gas7 mRNA在肾脏表达高于心脏，而在肝脏基本不表达；进一步的免疫组织化学定位检测发现，Gas7蛋白特异性地高表达于肾脏近髓肾单位的近曲小管上皮细胞的基底侧膜，少量表达于髓质的集合管，而肾小球和其它肾小管不表达；Gas7蛋白中等强度表达于心肌纤维的肌质和肌膜，肝脏组织未见表达。Gas7基因m RNA和蛋白在成年大鼠肾脏、心脏和肝脏表达的差异性，说明Gas7基因在成年大鼠肾脏、心脏结构和功能的维持中起着重要作用。本实验结果为进一步进行Gas7基因的功能研究和阐明肾脏、心脏生理活动的分子生物学机制提供了参考资料。

Gas是一个基因大家族，家族各成员最初均是从培养基中去掉血清成分后而处于静止期的细胞中分离出来的。但Gas基因家族各成员间缺少序列同源性，从而各成员具有各种各样不同的生物学功能。Gas7基因是Gas基因家族中的一员，目前的资料显示，Gas7主要表达于神经系统，特异高表达于小脑的浦肯野细胞，并能促进体外培养的小脑细胞的成熟［1］。过度表达能诱导培养的Neuro－2a细胞膜表面突起的形成，并能促进神经生长因子处理过的PC12细胞向神经元方向的分化，促进其突起的形成［1，6，7］。结构决定功能，这是因为 Gas7蛋白羧基末端有一序列氨基酸残基能直接与actin相互作用，促进其组装、交联成束，从而形成低聚体，来完成细胞骨架的变形和装配［8，9］。最近资料报道，Gas7被分类进入 PCH（Pombe Cdc15 Homology）家族［10，11］，PCH 是一组连接蛋白，能调节胞浆移动、胞质分裂和细胞膜的动力学。大部分PCH蛋白拥有一个相同的FCH（Fes／CIP4 Homology）结构域［10］，而含有FCH结构域的蛋白能结合actin，参与细胞支架的重组、囊泡运输和胞吞作用［12］。肾实质由肾单位和集合管构成，共同完成尿的生成过程。肾单位按其所在的部位分为皮质肾单位和近髓肾单位，皮质肾单位在尿液的生成中起重要作用，而近髓肾单位与尿液浓缩密切相关。肾单位由肾小体及与之相连的肾小管构成。肾小体由肾小球和肾小囊组成，肾小囊与肾小管相互延续。肾小管包括近端小管、髓袢和远端小管，远端小管的末端与集合管系相连。在尿液形成的过程中，近端小管是原尿重吸收的重要场所，而远端小管和集合管是尿液浓缩的主要部位。

本实验中，Gas7蛋白选择性地表达于近髓肾单位，提示Gas7可能参与尿液的浓缩功能。同时Gas7特异性地表达于近曲小管。近曲小管的上皮细胞侧面有许多指状突起，相邻细胞侧突相互交叉，造成光镜下细胞境界不清；上皮细胞的基底部有发达的质膜内褶，侧突和质膜内褶大大增加了细胞侧面和基底面的面积，有利于物质交换。侧突仅存在于近端小管，髓袢、远端小管和集合管没有。结合Gas7蛋白的结构和功能，高表达于近曲小管的Gas7蛋白可能与该处上皮细胞侧突、质膜内褶的形成和维持有关，参与该处上皮胞浆囊泡运输，胞吞等过程中细胞膜结构和形态的改变，促进物质的重吸收与分泌。Gas7蛋白在肾脏组织内差异表达的机制有待于进一步研究来提供合理的解释。

心肌纤维呈短圆柱状，有分支并互相连接成网。心肌的肌原纤维较骨骼肌少，多分布在肌纤维的周边，肌原纤维含有三种蛋白质：actin、原肌球蛋白和肌钙蛋白。本文观察到Gas7蛋白在心肌有表达，主要分布于肌质的周边，位于心肌肌原纤维所处的部分。根据Gas7蛋白的结构和功能，我们推测，Gas7蛋白可能与分布在肌纤维周边部分的actin相互作用，参与心肌纤维分支的形成和维护，调节心肌纤维收缩和舒张时细胞形态的改变。

综上所述，Gas7在成年大鼠肾脏、心脏和肝脏的差异性表达，说明Gas7在成年大鼠肾脏、心脏结构和功能的维持中可能起着重要作用，而基本不参与肝脏的功能活动。其具体机制有待进一步研究。

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