GS、E－cadherin和β－catenin在肝细胞癌中的表达及其临床意义

周新木 陈丽荣

（1浙江大学医学院附属第二医院病理科，杭州321000；2浙江省丽水市中心医院病理科，丽水323000）

肝细胞癌是常见、高发的恶性肿瘤之一，在我国已经成为恶性肿瘤的第2位的杀手。由于肝细胞癌易转移及复发，预后差，如何能在肝细胞癌尚未出现转移前及早预测、诊断，并及时采取有效措施就成为能否进一步提高肝细胞癌治疗效果的关键。本研究采用免疫组织化学Envision法检测谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase GS）、E－钙粘蛋白（E－cad－herin）和β－连环蛋白（β－catenin）在肝细胞癌中的表达情况，探讨其与肝细胞癌临床病理及预后的关系。

材料和方法

1．一般资料

收集浙江大学医学院附属第二医院和浙江省丽水市中心医院2001年1月－2011年12月行肝细胞癌手术切除标本182例，及其相应的癌旁肝组织标本92例。全部病例均经手术和病理证实，术前均未行放疗或化疗，具有完整的病理资料。所有标本均经40g／L缓冲中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片。182例病例中男性143例，女性39例；年龄32－87岁，中位年龄58岁；肿瘤最大径＜5cm 125例，肿瘤最大径≥5cm 57例；高分化（Edmonson分级1－2）81例，低分化（Edmonson分级3－4）101例；脉管内瘤栓定义为HE组织切片检查于血管或淋巴管内见癌细胞者，有脉管内瘤栓55例，无脉管内瘤栓127例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期117例，Ⅲ和Ⅳ期65例；肝外转移29例（肺15例，椎体10例，肋骨2例，肾上腺1例，脑1例），肝内转移12例，无转移141例；术后复发75例，术后无复发107例。

2．试剂

鼠抗人GS单克隆抗体（clone GS－6）购自美国Chemicon International Inc．公司。即用型免疫组化EnVision试剂盒（试剂盒号87－8963SuperpictureTM 3rd Gen IHC Dettion Kit）购自北京中杉公司。即用型鼠抗人E－cadherin（clone MAB－0589）和即用型鼠抗人β－catenin单克隆抗体（clone CAT－5H10）均购自福州迈新公司。

3实验方法

采用免疫组织化学EnVision二步法，石蜡切片经脱蜡，梯度酒精水化后，抗原热修复，用3%双氧水室温孵育20min，消除内源性过氧化物酶的活性，pH7．2磷酸盐缓冲液冲洗，加入一抗（GS 1∶450；E－cadherin 1∶50；β－catenin 1∶50），37℃恒温水箱孵育1h，PBS冲洗，滴加EnVisionTM通用型二抗50μl，置于37℃恒温水箱孵育25－30min。DAB显色，苏木素复染，封片，镜检。所有抗体阴性对照以PBS代替第一抗体。E－cadherin和β－catenin抗体阳性对照选择已知阳性标本为对照。

4．结果判断

GS结果判断：GS阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色颗粒着色。采用二级计分法，首先按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率＜10%为0分，10%－25%为1 分，＞25%－50%为2分，＞50%－75%为3分，＞75%为4分。将二者相加得综合免疫组化评分：≤3分为阴性，＞3为阳性。E－cadherin和β－catenin结果判断：于肿瘤细胞质或细胞核表达≥10%，称为异位表达；不表达或细胞膜表达＜10%称为细胞膜表达缺失；异位表达和细胞膜表达缺失统称为异常表达，单纯细胞膜表达为正常表达［1］，异常表达为阳性，正常表达为阴性。免疫组化结果由两位病理医师采用双盲法读片评定。

5．统计学方法

采用SPSS16．0软件进行数据分析。两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验；多样本率的比较采用行χ列表资料的χ2检验；参数间的相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0．05为有显著性差异。

结 果

1．肝细胞癌和癌旁肝组织中GS、E－cadherin、β－catenin的表达

GS在肝细胞癌细胞中呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞质（图1），阳性表达率为77．5%；癌旁肝组织表达率为4．3%，差异显著（P＜0．05）。E－cadherin和β－catenin在癌旁肝组织呈棕黄色颗粒，定位于细胞膜，异常表达率分别为30．4%和26．1%；肝细胞癌中则主要表现出不同程度的细胞质和或细胞核显色（图2，3），而细胞膜的显色减少，表现为异位表达和表达缺失，异常表达率分别为59．3%和58．8%，与癌旁肝组织差异显著（P＜0．05）（表1）。

2．肝细胞癌 GS、E－cadherin、β－catenin表达与临床病理参数之间的关系

GS在肝细胞癌TNM分期Ⅲ＋Ⅳ组的阳性表达率明显高于Ⅰ＋Ⅱ组，差异显著（P＜0．05）；GS在肝外和肝内转移组中阳性表达率高于无转移组，差异显著（P＜0．05）；GS在术后有复发组中阳性表达率高于术后无复发组，差异显著（P＜0．05）；而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度和脉管内瘤栓无关（P＞0．05）。E－cadherin和β－catenin异常表达与脉管内瘤栓、TNM分期、转移和术后复发相关，差异显著（P＜0．05）；而与年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无关（P＞0．05）（表2）。

图1 GS在肝细胞癌中阳性表达（Envision×100）图2 E－cadherin在肝细胞癌细胞质异常表达（Envision×100）图3 β－catenin在肝细胞癌细胞核异常表达（Envision×100）Fig．1Positive expression of GS in hepatocellular carcinoma（EnvisionTM×100）Fig．2Aberrant expression of E－cadherin in hepatocellular carcinoma cytoplasm（EnvisionTM×100）Fig．3Aberrant expression ofβ－catenin in hepatocellular carcinoma nucleus（EnvisionTM×100）

表1 肝细胞癌和癌旁肝组织中 GS、E－cadherin、β－catenin的表达Table 1 Expression of GS，E－cadherin，β－catenin in hepatocellular carcinoma and adjacent non－neoplastic liver tissue

表2 182例肝细胞癌中GS、E－cadherin和β－catenin的表达与临床病理参数的关系Table 2 Correlation of GS，E－cadherin，β－catenin expression to clinicopathological characterisitics of 182patiens in hepatocellular carcinoma

3．肝细胞癌中 GS表达与 E－cadherin、β－catenin表达之间的关系

GS在肝细胞癌中与E－cadherin共表达90例（r1＝0．169），与β－catenin共表达89例（r2＝0．163），具有正相关性（P＜0．05）。

讨 论

肝细胞癌发生发展是一个多基因参与、多因素影响、牵涉多条信号传导途径的复杂过程。Wnt信号通路由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白共同构成，参与细胞的增殖、代谢和凋亡过程，并维持内环境的稳定，其异常激活与肿瘤的发生发展有关［2，3］。GS作为Wnt信号通路的靶基因，伴随β－catenin的异常激活而导致许多人类疾病的发生。有研究报道，GS可作为AFP低水平表达的早期原发性肝癌的新的标记物［4，5］。本研究结果显示，肝细胞癌GS表达水平高于癌旁肝组织，并且与肝细胞癌TNM分期、转移和术后复发显著相关，临床分期越高，蛋白表达程度越高，与Osada等研究基本一致［6，7］。提示GS在肝细胞癌的发生和发展过程中起着关键作用，GS与恶性肿瘤细胞侵袭性密切相关，高表达可促进恶性肿瘤细胞转移，其机制可能是肝细胞癌中GS高表达，可以使肿瘤细胞不仅依赖宿主提供谷氨酰胺而自行合成，从而为肿瘤细胞合成核甘酸提供原料，有利于克服不利的生长环境，而不断增殖，进而增强了肿瘤的生存能力。

E－cadherin／β－catenin细胞粘附复合体，与细胞骨架相连，在维持细胞间的正常粘附中起到重要作用，在上皮组织中强表达，主要位于同种上皮细胞膜上的细胞连接处。研究发现 E－cadherin／β－catenin在很多肿瘤中相对于正常组织低表达，或称为异位表达、缺失表达，并与淋巴结转移、肿瘤分化程度相关［8－11］。本研 究 结 果 显 示，E－cadherin／β－catenin 在肝细胞癌中异位表达、缺失表达（异常表达）高于对照组，且与脉管内瘤栓、TNM分期、转移和术后复发相关，说明 E－cadherin／β－catenin所代表的上皮标志物的缺失，可能是肝细胞癌细胞获得更强的侵袭和转移能力的机制之一。

GS是β－catenin的靶基因，GS阳性可以作为Wnt信号通路中关键点β－catenin突变的标记，高表达与β－catenin基因变异或者是通路激活有关［3］。本研究显示肝细胞癌GS高表达与E－cadherin／βcatenin异常表达呈正相关。其机制可能是：①βcatenin降解系统障碍，使其在细胞浆内积聚，过多的β－catenin进入细胞核，激活细胞生长发育关键通路的Wnt信号传导通路，由此引起细胞增殖，分化失控，导致肿瘤的发生。而且胞质内β－catenin积聚还能导致下游靶基因GS转录激活，促进肿瘤侵袭转移。②β－catenin异位表达和E－cadherin的膜表达缺失均可导致E－cadherin和β－catenin不能形成复合物，上皮细胞间的黏附能力下降或丧失，使肿瘤发生浸润转移的危险性增加［12］。

综上所述，肝细胞癌中GS的高表达，与E－cadherin和β－catenin表达的下调，可能是肝细胞癌侵袭和转移的重要机制之一，联合检测GS、E－cadherin和β－catenin可能有助于判断肝细胞癌的恶性程度、转移潜能及预后分析。随着对肝细胞癌发生、发展机制研究的逐步深入，开展 Wnt信号通路GS靶基因的基因诊断及治疗，有可能为人类肝细胞癌及其他肿瘤的早期防治开辟广阔的前景。

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