动物脂肪沉积的分子调控机制

滑留帅，王 璟，李明勋，孙晓梅，杨东英，陈 宏＊

引言

长期以来，脂肪组织一直被当做是具有能量的储存功能，用于调节机体的能量稳态平衡，当能量供应充足时，脂肪细胞储存甘油三酯，而当能量供应不足时，脂肪细胞释放甘油三酯以供能。1994年，首个脂肪细胞因子Leptin被鉴定［1］，之后又有一系列的脂肪细胞因子被发现，例如TNFa（tumour necrosis factor－a），脂联素（adiponectin）、抵抗素 （resistin）、adipsin、visfatin、白介素 6（interleukin，IL－6，chemokines等［2］。这些脂肪细胞因子的发现让人们逐渐认识到脂肪组织是一个复杂且高度活跃的分泌结构，对于调节机体代谢至关重要，它参与包括食欲、能量平衡、胰岛素敏感性、繁殖、骨形成、炎症反应和免疫等一些过程的调控［2，3］。

由于脂肪组织对机体具有丰富的调控功能，且脂肪功能紊乱多与人类的肥胖症、II型糖尿病等人类重大疾病相关联，动物脂肪沉积的分子调控机制的研究也备受人们关注，本文综述了目前在模式动物上研究的相对较为透彻的一些调控通路以及调控因子。

1 PPARg和C／EBPs是脂肪细胞分化调控的核心基因

多潜能的MSCs在分化过程中形态和功能都发生了转变，梭形的成纤维细胞变成了圆形的富含脂滴的成熟的脂肪细胞，这个过程包含复杂的调控因子和调控通路的互作。目前研究比较透彻的包括：CAAT／enhancer binding proteins （C／EBPs），peroxisome proliferator－activated receptor gamma（PPARg），adipocyte determination and differentiation－dependent factor－1／sterol regulatory elementbinding protein－1（ADD－1／SREBP－1）等。在受到脂肪分化因素的刺激后，C／EBPb和C／EBPd首先被诱导表达，然后进一步诱导PPARg和C／EBPa自反馈环的表达。其中C／EBPa表达后可以结合在PPARg的启动子区诱导PPARg的表达，而表达PPARg又能进一步增加C／EBPa的表达。在PPARg和C／EBPa的相互作用下，脂肪细胞特异性基因被进一步诱导表达［4，5］。这些基因多与甘油三酯的合成与储存有关，如脂肪酸结合蛋白（fatty acid－binding protein，aP2），脂酰辅酶 A 合成酶（ac－yl－CoA synthetase），脂肪酸转运蛋白（fatty acid transport protein－1），脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）等［6］。

PPARg属于配体激活转录因子核受体超家族的一员，抗糖尿病药物TZD（thiazolidinedione）的靶基因就是PPARg。早期工作表明PPARg是诱导脂肪分化的充分且必需条件，直到目前为止，没有哪个基因能够在缺失PPARg的情况下启动脂肪细胞的分化［7］。另外体内和体外的研究都证明PPARg对于成熟脂肪细胞的功能维持同样非常的重要。在3T3－L1细胞中利用RNAi敲低PPARg，能够导致脂肪细胞特异性代谢基因的表达降低和对胰岛素敏感性的降低，但是细胞的形态并没有发生变化。在小鼠模型上，敲除脂肪组织中的PPARg，能够导致细胞的凋亡，这说明成熟脂肪细胞的生存和脂滴含量的维持需要一定量的PPARg，例如在RNAi试验中敲低PPARg能够继续维持细胞的形态，但是在小鼠模型中完全敲除PPARg则导致细胞不能存活［8，9］。

PPARg基因有两个剪切体PPARg1和PPARg2，他们分别由不同启动子启动。其中PPARg2特异性的在脂肪细胞中高表达，而PPARg1还在多个组织中广泛表达［10］。作为一个核受体，PPARg拥有其他类似的二级结构，如配体依赖激活域、DNA结合域，铰链域和配体结合域。PPARg能与视黄酸受体a（Retinoid X Receptor a，RXRa）结合形成异源二聚体，然后结合在靶基因的PPRE（peroxisome proliferator response elements）上启动靶基因的表达，因此视黄酸能够通过RXRa与PPARg的互作来影响脂肪的生成［11］。通过全基因组分析表明，在3T3－L1细胞中PPARg大约有5 300个结合位点，大部分都与PPRE元件有关，并且同时与RXRa相结合。有许多已知的PPARg靶基因都含有多个PPRE元件。PPARg能够在没有配体的情况下与靶基因相结合，这时它往往与共抑制因子 NCoR（nuclear receptor corepressor）和SMRT（silencing mediator for retinoid and thyroid receptors）相关联。这两个共抑制因子能够招募组蛋白去乙酰化酶和其他染色体修饰酶来抑制转录。NCoR、SMRT和组蛋白去乙酰化酶如Sirt1和Sirt2属于脂肪分化的负调控因子［12－14］。配体的结合能够导致PPARg构象的改变，从而为共激活因子，如类固醇受体共激活因子（steroid receptor coactivators，SRCs），产生一个结合位点（docking site）。许多研究分析了共调控因子在脂肪分化中是必需的。受体互作蛋白140（Receptor－interacting protein 140，RIP140）作为一个共调控因子，能够结合在配体受体上进而抑制转录，例如RIP140能够抑制PGC1a（peroxisome proliferator－activated receptor－g coactivator－1a，PGC－1a）的活性。PGC1a作为 PPARg的一个共激活因子能够诱导线粒体的生成和UCP－1（uncoupling protein 1）的表达，从而对能量消耗和棕色脂肪的发育有关键的调控作用［15］。

C／EBPs（包括C／EBPa、C／EBPb和C／EBPd三种亚型）属于一类高度保守的亮氨酸拉链蛋白，他们在脂肪细胞分化的调控中也具有核心的作用，敲除C／EBPs基因能导致严重的脂肪异常［16］。全身敲除C／EBPa的小鼠出生后很快会因为肝脏发育缺陷、低血糖、白色和棕色脂肪不能沉积脂质而死去。即便肝脏功能被恢复，也完全没有白色脂肪的沉积，但是乳腺和棕色脂肪发育正常，这样的动物往往伴随着显著的代谢异常，如高血脂、高胰岛素和脂肪肝等。在成年小鼠中全身敲除C／EBPa能够导致皮下脂肪的减少，说明C／EBPa对于成熟的脂肪细胞也很重要。缺失C／EBPb或C／EBPd会损害白色脂肪的生成，而两者共缺失，将产生更严重的影响。大约有80%的C／EBPb和C／EBPd共缺失小鼠会在出生后死掉，而部分能够长至成年。但是有趣的是，尽管共缺失小鼠全身的脂肪量显著减少，但PPARg、C／EBPa和aP2的表达正常，说明体内存在其他的补偿机制［17］。

C／EBPa在脂肪分化的晚期诱导表达，并且在成熟的脂肪细胞中含量丰富，C／EBPa对胰岛素依赖的葡萄糖摄入也很关键。全基因组分析表明，细胞中存在上千个C／EBPa结合位点，并且大部分都与PPARg的结合位点共定位。在C／EBPa敲除的小鼠胚胎成纤维细胞 （mouse embryonic fibroblasts，MEF）中，异位过表达PPARg能够拯救其脂肪分化能力，说明C／EBPa在脂肪细胞中并不是不可或缺的，C／EBP的其它成员可能在一定程度上能够补偿其功能［18］。事实上，C／EBPb与 C／EBPa有着相似的DNA结合特征，并且C／EBPb在成熟的脂肪细胞中保留有转录活性。共缺失C／EBPa和C／EBPb能够显著降低许多基因的表达，如aP2，脂联素，激素敏感酯酶等。这些都说明，与PPARg类似，C／EBPs在转录调控脂肪细胞分化上具有关键的作用，但PPARg与C／EBPs的精确互作机制仍需进一步阐释［19］。

2 Hedgehog信号通路

Hedgehog信号通路是动物发育的重要信号通路之一，其参与调节动物的胚胎发育、体节形成、脊索发育、大脑发育等重要过程［20－22］。哺乳动物存在三种hedgehog蛋白，SHH（sonic hedgehog），IHH（india hedgehog）和 DHH（desert hedgehog），其中SHH被研究的最为透彻。SHH在表达过程中，首先作为一种前体蛋白被表达出来，经过蛋白水解和脂质修饰后才成为成熟的有功能的蛋白。分泌的SHH会被一个含有12次跨膜区域的蛋白受体PTC（patched）所识别，PTC有两个同源体，PTCH1和PTCH2，其中PTCH1起主要介导作用。SHH与PTC结合后，促使PTC其释放一个关联蛋白SMO（smoothened）。SMO 然后与 Glis（glioma－associated oncogenes）相结合诱导下游基因的表达。胞内的Glis有三种类型，Gli1，Gli2和Gli3。其中Gli1和Gli2主要作为转录激活因子，而Gli3作为转录抑制因子。Glis下游的效应基因包括Myf5等，Glis能通过Pax3／7以及 Myf5促进肌肉的发育［23，24］。

一直以来，Hegehog信号通路被认为仅在胚胎发育阶段发挥作用，越来越多的证据表明，SHH信号通路在脂肪生成中也有重要的作用。肥胖能够下调SHH信号通路的表达水平，包括SMO，Gli1，Gli2和Gli3［25］。激活SHH信号通路能够抑制前脂肪细胞的分化，在诱导脂肪细胞分化时，降低SHH信号通路的表达水平是必要但非充分的条件。SHH信号通路能够促进干细胞分化为成肌细胞或成骨细胞，而抑制SHH的表达则有助于脂肪细胞的分化。SHH信号通路与脂肪生成间的机制目前并不是非常的清楚。GATA2（GATA binding protein 2）可能一定程度上介导了SHH的抑制脂肪细胞分化功能。GATA2能够与PPARg和CEBPa直接互作，进而抑制PPARg的促脂肪分化能力［9，26］。在抑制脂肪细胞分化的同时，GATA2能够招募MEF2（myogenic enhancer factor－2）进而促进肌肉细胞的分化。SHH抑制脂肪细胞分化的另一个途径可能由COUP－TFII（chicken ovalbumin upstream promoter－transcription factor II，COUP－TFII，也称作Nr2f2）来介导［27］。表达SHH能够诱导Nr2f2的表达，而Nr2f2能够结合在PPARg和C／EBPa的启动子区进而抑制他们的表达［28－30］。

3 Wnt／beta－catenin信号通路

Wnt是一种分泌性糖蛋白，对多种细胞类型和组织的发育有重要的调控作用［31］。经典的 Wnt信号通路依赖于β－catenin，所以称为 Wnt／β－catenin信号通路。Wnt与Frizzled蛋白的结合能够激活DSH（disheveled）蛋白家族，然后进一步抑制一个包含axin，GSK－3β（glycogen synthesis kinase－3β）和APC（anaphase－promoting complex）的蛋白复合体，然后导致β－catenin的聚集［32］。如果没有 Wnt的刺激，axin／GSK－3β／APC蛋白复合体就会通过磷酸化降解 β－catenin［33］。稳定的β－catenin入核后会与TCF／LEF（T cell factor／Lymphoid enhancer factor）转录因子家族相结合，进而激活特异性的靶基因。因此β－catenin在Wnt信号通路中起到了至关重要的作用。在骨骼肌中，β－catenin能够调节Pax3和Gli的表达，Pax3位于MyoD的上游在肌肉生成中具有重要作用，而Gli能够诱导Myf5的表达［34，35］。在培养的间充质干细胞中激活 Wnt信号通路能够增加肌肉生成而抑制脂肪生成，阻断 Wn t／β－catenin信号通路能够抑制肌肉的生成［36］。

除了通过TCF／LEF转录因子诱导肌肉生成，β－catenin还能够通过FOXO（forkhead transcription factors）共调控因子来发挥作用［37］。在哺乳动物细胞中，β－catenin能够与FOXO相结合，进而增强其转录活性。炎症和氧化应激能够增加FOXO的表达，从而导致部分正常情况下与TCF相结合的βcatenin现在与FOXO相结合［38］。另外Wnt／βcatenin也可以通过Nr2f2来调控脂肪生成，Wnt／βcatenin能够激活Nr2f2的表达，进而招募SMRT共抑制复合体来抑制PPARg1和PPARg2的表达。

4 BMPs

骨形态蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）能够调控多种细胞通路，例如细胞分化、增殖和凋亡。BMPs属于 TGFβ（transforming growth factorβ）超家族。BMP信号通路的激活需要type I和type II两类受体，两类受体都包含丝氨酸／苏氨酸激酶活性结构域。与BMPs结合后，II型受体的激酶活性被激活，然后磷酸化I型受体，进而导致固有的丝氨酸／苏氨酸激酶激活，进一步磷酸化Smad1，5，8。磷酸化的Smad1，5，8与Smad 4形成异源二聚体，然后迁移入核启动下游基因表达。

在哺乳动物中目前共鉴定到了15种BMP蛋白，其中BMP－2和BMP－4能够调节脂肪生成和骨生成，而 BMP－7 能够促进棕色脂肪的生成［39］。BMPs对脂肪生成的调控作用具有剂量依赖性。在低剂量的时候能够促进脂肪生成，但高剂量的时候能够促进骨的生成。低水平的BMP－2，4能够促进白色脂肪的生成，但BMP－7促进棕色脂肪的生成。BMP－2，4，7都能够诱导胞内脂滴的聚集和PPARg的表达，但只有BMP－7能够促进 UCP－1的表达，UCP－1是棕色脂肪的标志基因，另外棕色脂肪的另一个关键调控因子PRDM16也能够被BMP－7所诱导表达［39，40］。

BMP－2能够通过Smad1和p38促进脂肪分化，Smad1，5，8更倾向于与富含GC的元件结合而不是Smad特异性元件（5＇－GTCTAGAC－3＇），一 般Smad2，3更倾向于与特异性元件结合［41］。因为Smad1，5，8没有特异性的结合位点，所以共激活因子对于BMP特异性靶基因的选择非常的重要。Shn（Schnurri）就是一个共激活因子，在脊椎动物中，Shn有三个同源类型，Shn－1，2，3。Shn－2敲除鼠表现出更低的脂肪沉积。在BMP－2的刺激下，Shn－2入核后与Smad1／4和C／EBPa形成复合体，诱导PPARg的表达。总体来说，BMP调控脂肪的途径还不是非常的清晰，需要进一步的试验研究来证明和阐释。

5 KLFs

大量的证据表明 KLFs（Krupel－like factors）在脂肪分化过程中具有重要的作用，这类蛋白由一大家族锌指转录因子组成，他们可以结合在CACCC和GC－rich的DNA片段上，因细胞或基因组的位置不同而起激活或抑制作用［42］，KLFs在脂肪分化中也有不同的作用。KLF4能够在脂肪细胞分化的前24个小时瞬时表达，然后激活C／EBPb的表达，一般认为KLF4参与脂肪分化的早期程序。KLF4与另一个锌指蛋白Krox20可以互作，Krox20也对脂肪分化有正向调控作用［43］。KLF6、KLF5 和KLF15也对脂肪细胞分化有促进作用。KLF6能够结合在DLK1的启动子区招募HDAC3进而抑制DLK1的转录。KLF5杂合子新生小鼠拥有更少的脂肪含量，更小的脂肪细胞和脂肪细胞特异性基因的表达下调，这都源于脂肪细胞分化缺陷。另外研究表明，KLF5与C／EBPb、C／EBPd有互作从而能够参与早期脂肪细胞的分化。同样，KLF15能够在脂肪分化的后期与C／EBPa互作，激活PPARg的表达［44］。KLF2在前脂肪细胞中表达，能够抑制PPARg的启动活性，进而抑制脂肪细胞的分化。KLF3同样也具有抑制脂肪细胞分化的作用，它发挥作用的机制可能是招募碳端结合蛋白（C－terminal binding protein，CtBP）共抑制因子进而抑制C／EBPa的表达。但是比较奇怪的是，KLF3敲除小鼠却含有更少的脂肪块和更小脂肪细胞体积和数量，需要有进一步的工作来阐释KLFs家族在脂肪分化中的作用，以及他们与PPARg和C／EBPs的互作。

6 Insulin和IGF1

胰岛素对于脂肪细胞分化有很显著的影响。在脂肪细胞分化早期，胰岛素主要通过胰岛素生长因子1（insulin growth factor－1，IGF1）发挥作用，因为前体脂肪细胞表达更多的IGF1受体而不是Insulin受体，不过这个比例随着分化的进行而发生改变。缺失胰岛素受体的鼠成纤维细胞和棕色前体脂肪细胞会失去脂肪分化的能力，但是脂肪组织特异敲除胰岛素受体的小鼠却有脂肪组织的生成，这可能是因为用于启动Cre重组酶表达的Fabp4启动子直到脂肪细胞分化启动以后才具有启动活性所致。同时，IGF1受体可以在体内能够补偿胰岛素受体的缺失，但体外环境中却不行［6］。胰岛素／IGF1信号通路下游的因子对于脂肪分化也很重要。缺失某个胰岛素受体底物（insulin－receptor substrate，IRS）蛋白会抑制脂肪生成，而且IRS的重要性依次为IR S1＞IRS3＞IRS2＞IRS4。在体外双敲除IRS1和IRS2会阻止脂肪细胞分化，IRS1／IRS3双敲除小鼠则表现明显的脂肪萎缩，虽然棕色脂肪组织发育相对正常［45］。在胰岛素信号通路的更下游，抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol－3kinase，PI3K）以及缺失 AKT1／蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）或AKT2／PKB都会抑制脂肪生成。基因敲除AKT1和AKT2的小鼠会出现脂肪萎缩，而且这些小鼠的MSCs无法分化［46］。这个通路的重要性在人类研究得到证实，携带AKT2突变的家族成员会得脂肪萎缩性糖尿病［47］。其他胰岛素下游的效应因子，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）被证明参与了脂肪细胞分化调控，最新研究表明mTOR同时还与动物的寿命密切相关［48］，进一步说明动物脂肪组织的代谢能够影响机体的健康与寿命。

7 其他调控机制

除过这些被研究的相对透彻的调控因子与通路外，还有一些其他机制参与调控脂肪的分化生成，如组蛋白修饰［49］、miRNA、蛋白质的泛素化修饰［50］、未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）［51，52］、氧化应激［53］、细胞自噬［54］、昼夜节律［55］等，不过这些机制不如前面的研究透彻。

8 展望

脂肪组织作为一个能量储存和分泌分泌器官，对于机体的能量平衡及生理调控具有重要的作用。脂肪沉积是一个包含脂肪细胞分化、甘油三酯合成与水解、脂肪细胞凋亡等内容的复杂生物过程，其分子调控机制错综复杂，目前还需要更多的研究工作来解释这个生物过程，例如继续挖掘细化已知的调控通路，寻找新的信号通路及重要调控基因，鉴定这些已知的通路在脂肪生成中的相互作用等。阐释脂肪沉积的分子调控机制，有助于我们理解脂肪代谢相关疾病的生物学基础，从而为治疗及预防这些疾病提供理论依据，同时由于目前关于脂肪生成的理论和知识大都来自于小鼠和人的研究，因此验证这些信号通路在家畜上的调控机制，对于动物育种也具有重要的意义。

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