竹黄菌固态发酵产竹红菌素条件的优化

吕腾飞 ， 丁彦蕊 ， 廖祥儒 ， 蔡宇杰 *

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；3.江南大学 物联网工程学院，江苏 无锡214122）

竹黄（Shiraia bambusicola），俗称竹花，赤团子，竹赤团子等[1]，属于子囊菌亚门中的核菌纲、球壳目、肉座菌科（Hypocreaceae）、竹黄属（Sharaia）。 竹黄主要寄主为箭竹属和短穗竹属植物，主要分布在江西、浙江、江苏、湖北、湖南、安徽、贵州和云南等地，以及亚洲的日本[2]。是一种特异性寄生在某些竹子嫩枝上的药用真菌，药用部分为其子座，具有止咳祛痛、舒筋活络、祛风利湿等功效，可用于风湿性关节炎、坐骨神经痛、急性肝炎等[3]，在民间常用其泡酒，用以治疗跌打损伤、虚寒胃痛等症[4-5]。竹红菌素被认为是竹黄中主要的有效成分之一，由多种苝醌类衍生物组成[6-7]。近年来发现竹红菌素具有优良的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制艾滋病病毒的作用，并且是一种新型的光活化农药和潜在的光电转化材料，在世界范围内正被广泛的研究[8]。

从竹黄子座中直接提取获得竹红菌素的技术在国内外都有报道[9]，然而竹黄野外采集资源有限，而且容易造成竹林衰败。近年来，通过液态发酵和固态发酵的方法获得竹红菌素取得了一定的进展[10-11]。项晓燕等（2012）通过优化竹红菌素的液态发酵条件，色素产量达到了7.68 mg/g菌体[12]；蔡宇杰等（2004）利用固态发酵生物合成竹红菌素，色素产量达到了40 mg/kg培养基[9]，为解决竹红菌素的来源提供了新思路。

相较于液态发酵，固态发酵具有节水节能的独特优势，而且几乎没有废液排放，属于清洁生产技术，在发酵领域日益受到重视[13]。作者采用固态发酵的方法，研究了培养基组成、种龄、接种量、初始含水量和温度等对竹红菌素产量的影响，以期能为规模化生产提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

竹黄菌 （Shiraia bambusicola）SUPER-H168:作者所在实验室保藏。

1.2 培养基

斜面培养基（g/dL）:马铃薯 20，葡萄糖 2，琼脂2；pH 自然。

种子培养基 （g/dL）:马铃薯 20， 葡萄糖 2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；pH 自然。

基础培养基:玉米（颗粒度 18～16目）25 g，麦秸秆（20 目）5 g，蒸馏水 30 mL，pH 自然。

上述培养基均在121℃下灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 孢子悬液的制备 斜面种子于30℃培养5～7 d至长出大量孢子，用20 mL无菌水洗下孢子，玻璃珠将孢子充分打碎，配置成106个/mL的孢子悬浮液。

1.3.2 色素检测方法 将固态培养物于烘箱中70℃烘干至恒重，准确称取1.00 g，研钵研碎，用30 mL无水乙醇在30℃条件下提取两次，每次40 min，抽滤后得澄清液，用旋蒸仪蒸发干，甲醇溶解并适当稀释后，用分光光度计在465 nm处测定其吸光值[14]，根据回归方程 y=0.036 4x+0.044 1（R2=0.999）计算色素的含量，其中y为吸光度值，x为色素质量浓度（mg/L）。

1.3.3 玉米颗粒度和麦秸秆添加量的优化 选择不同的玉米粒径和麦秸秆添加量进行组合实验，以确定最佳的配比。

1.3.4 初始含水量的优化 选择初始含水量在35%～70%的各个水平，通过实验确定最适含水量。

1.3.5 培养温度的优化 固态发酵培养基接种后，分别在 24、26、28、30、32 ℃条件下培养，以确定最佳培养温度。

1.3.6 种龄的优化 接种1.3.1所述孢子悬液2 mL于50 mL种子培养基中，在30℃、200 r/min分别振荡培养 12，24，36，48，72 h 作为固态发酵的种子液。

1.3.7 接种量的优化 每30 g固态发酵基质（以干重计）分别接种 1、2、3、4、5 mL 液体种子，以确定最佳的接种量。

1.3.8 外加碳、氮源以及无机盐的优化 以葡萄糖为 外 加 碳 源 ，NH4Cl 为 外 加 氮 源 ，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4为无机盐， 按照表 1设计 7因素3水平正交实验。

表1 正交实验设计Table 1 Orthogonal design

2 结果及分析

2.1 玉米颗粒度和麦秸量的优化

固态发酵中加入麦秸粉末有助于改善氧气和热量的传递情况，并且能使培养基蓬松，为菌丝体的生长提供良好的条件；但是麦秸量太多，在培养基制备过程中就会吸收更多的水分，而分配在玉米颗粒上的水分减少，使玉米颗粒在蒸料过程中不能充分糊化，从而影响菌体的生长。玉米颗粒度过小，导致培养基在蒸料过程中容易结块，而颗粒度太大，又会影响菌体对玉米颗粒内部营养物质的利用，实验结果见表2。当麦秸的添加量为3 g，玉米的颗粒度为0.78～0.95 mm时，色素的产量最高，达1.42%（色素含量占培养基干重，下同）。

表2 玉米颗粒度和麦秸秆量对色素产量的影响Table 2 Effect of straw powder and maize grits on yield of pigment

2.2 初始含水量的优化

含水量是影响固态发酵的主要因素之一，从图1可知，含水量为50%时色素的产量最高，可达0.93%。

图1 初始含水量对色素产量的影响Fig.1 Effect of moisture content of beads on yieldof pigment

2.3 温度的优化

由图2可知，培养温度为30℃时，色素的产量最高，达1.09%。当温度低于28℃时，不仅最终的色素产量会下降，色素的合成时间也会推迟。 故选择30℃为最佳培养温度。

2.4 种龄的优化

种龄对种子的活性和种子的浓度都有较大的影响。种龄过短，则大部分菌体尚处在适应期，此时接种会延长前期菌体的生长时间；种龄过长，则菌体开始进入衰亡阶段，种子的活力也会急速下降，影响后期的发酵。由图3可知，当种龄为24 h时，色素的产量最高，达到1.44%。种龄超过24 h，色素的产量会迅速下降。

图2 温度对色素产量的影响Fig.2 Effect of temperature on yield of pigment

图3 种龄对色素产量的影响Fig.3 Effect of seed age on yield of pigment

2.5 接种量的优化

合适的接种量能缩短发酵周期，提高色素的产量。由图4可知，当接种量达到2 mL/30 g干重时，色素的产量达到1.66%。接种量继续提高，色素的产量会出现下降的趋势，因此选择2 mL/30 g干重为最佳的接种量。

图4 接种量对色素产量的影响Fig.4 Effect of inoculation amount of beads on yield of pigment

2.6 外加碳源、氮源及无机盐的优化

以葡萄糖为外加碳源，NH4Cl为外加氮源，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4为 无 机 盐 ， 按照表2设计7因素三水平正交实验，以确定各组分的质量分数及配比，结果见表3～4。

表3 实验数据及结果Table 3 Data and results of orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Tests of Between-Subjects Effects

表3表明，在各因素中，CaCl2的极差最大，其次 是 Glucose，KH2PO4，K2HPO4和 CuSO4，MgSO4； 而NH4Cl的极差最小。因此各因素的主次顺序为:CaCl2＞Glucose ＞KH2PO4＞CuSO4＞K2HPO4＞MgSO4＞NH4Cl。最佳的碳氮源及无机盐配比为:Glucose 5%，NH4Cl 1% ，CuSO40.05% ，CaCl20.10% ，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%。

表 4 方 差 分 析 表 明 ，Glucose，CuSO4，CaCl2，KH2PO4以及K2HPO4等五个因素在95%的置信度下对色素产量的影响都是显著的。

3 结语

作者通过对竹黄菌固态发酵产竹红菌素条件的研究，确定了适宜的培养基的成分和培养条件。最佳培养基配方及培养条件为:玉米颗粒度0.78～0.95 mm，麦秸添加量 10%，Glucose 5%，NH4Cl 1%，CuSO40.05%，CaCl20.10%，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%，初始含水量50%，培养温度30℃，种龄24 h，接种量2 mL/30 g干重，优化后竹红菌素产量达1.66%（占培养基干重）。在本实验中，发酵周期长达15 d，因此，有必要对发酵条件和过程做进一步优化，以期缩短发酵时间。

[1]刘天慧.食用菌概论[M].北京:中国展望出版社，1987:26.

[2]梁晓辉，蔡宇杰，廖祥儒，等.竹黄菌丝与竹黄子座成分比较分析[J].食品与生物技术学报，2009，28（5）:705-708.LIANG Xiao-hui，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Analysis of the chemical compositions of Shiraia sp.SUPER—H168 fermented mycelia and the stromata of Shiraia bambusicola[J].Joumal of Food Science and Biotechnology，2009，28（5）:705-708.（in Chinese）

[3]林海萍，陈声明，陈超龙，等.一种值得开发利用的药用真菌—竹黄[J].浙江林业科技，2002（22）:78.LIN Hai-ping，CHEN Sheng-ming，CHEN Chao-long，et al.Shiraia bambusicola，a medicinal fungi needed to be developed[J].Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology，2002（22）:78.（in Chinese）

[4]钟树荣，赵海，李安明，等.一种尚待开发的中药-竹黄[J].中草药，2002，33（4）:372-374.ZHONG Shu-rong，ZHAO Hai，LI An-ming，et al.Potential TCM-Shiraia bambusicola[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2002，33（4）:372-374.（in Chinese）

[5]梁晓辉，蔡宇杰，廖祥儒，等.药用真菌竹黄的研究进展[J].食品与生物技术学报，2008，27（5）:22-26.LIANG Xiao-hui，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.The progress of research on medicinal fungus shiraia bambusicola[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2008，27（5）:22-26.（in Chinese）

[6]蒋莉金，何玉英.竹红菌素类光敏剂的光物理、光化学及光生物[J].科学通报，2000，（45）19:2019-2033.JIANG li-jin，HE yu-ying.Photophysical，photochemisical and photobiological properties of hypocrellin[J].Chinese Science Bulletin，2000，（45）19:2019-2033.（in Chinese）

[7]王秀丽，孙振令，刘为忠，等.四种苝醌类光敏剂活性的比较[J].山东理工大学学报:自然科学版，2003，17（5）:21-24.WANG Xui-li，SUN Zhen-ling，LIU Wei-zhong，et al.Comparison between photosensitive activities of four perylenequinonoid derivatives[J].Journal of Shandong University of Technology:Natural Science Edition，2003，17（5）:21-24.（in Chinese）

[8]张俭，马岚.竹红菌素研究的进展[J].云南大学学报:自然科学版，2003，25（增刊）:184-188.ZHANG jian，MA lan.Recent advances of hypocrellin research[J].Journal of Yunnan University:Natural Sciences，2003，25（supplement）:184-188.（in Chinese）

[9]林海萍，陈虹，叶勇，等.竹黄竹红菌素含量的测定方法[J].浙江林学院学报，2002（12）:57.LIN Hai-ping，CHEN Hong，YE Yong，et al.Determining method for content of hypocrellin A in Shiraia bambusicola[J].Journal of Zhejiang Forestry College，2002（12）:57.（in Chinese）

[10]蔡宇杰，丁彦蕊，张大兵，等.竹黄菌的固态发酵竹红菌素的研究[J].生物技术，2004，14（4）:46-47.CAI Yu-jie，DING Yan-rui，ZHANG Da-bing，et al.Study on fermentation hypocrellin pigments by shiraia bambusicola henn.under solid condition[J].Biotechnology，2004，14（4）:46-47.（in Chinese）

[11]胡明明，蔡宇杰，廖祥儒，等.竹红菌素培养基的初步优化[J].食品与机械，2010，26（5）:141-143.HU Ming-ming，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Optimization on submerged fermentation media of hypocrellin[J].Food&Machinery，2010，26（5）:141-143.（in Chinese）

[12]项小燕，张中信.竹黄菌液体培养条件下产竹红菌素的研究[J].广西植物，2012，32（2）:264-268.XIANG Xiao-yan，ZHANG Zhong-xin.Study on fermentation hypocrellin by Shiraia bambusicola in submerged cultures[J].Guihaia，2012，32（2）:264-268.（in Chinese）

[13]黄达明，吴其飞，陆建明，等.固态发酵技术及其研究的进展[J].食品与发酵工业，2003，29（6）:87-91.HUANG Da-ming，WU Qi-fei，LU Jian-ming，et al.Current research progress of solid state fermentation technology and equipment[J].Food and Fermentation Industries，2003，29（6）:87-91.（in Chinese）

[14]刘为忠，李聪，陈远腾，等.苝醌类化合物总量的测定[J].云南化工，2000，27（2）:35-37.LIU Wei-zhong，LI Cong，CHEN Yuan-teng，et al.Determination of the total quantity of perylene quinonoids[J].Yunnan Chemical Technology，2000，27（2）:35-37.（in Chinese）