蚕蛹源ACE抑制肽的稳定性和抑制ACE动力学

贾俊强 ， 吴琼英 ， 徐金玲 ， 杜金娟 ， 颜 辉 ， 桂仲争

（1.江苏科技大学 蚕业研究所，江苏 镇江 212018；2.中国农业科学院 蚕业研究所，江苏 镇江 212018；3.江苏科技大学 生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018）

血管紧张素转换酶 （Angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE）是一种调节人体血压的二肽羧基肽酶，广泛分布在人体组织和血浆中，且在肺毛细血管中的含量最为丰富[1]。ACE通过控制肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system，RAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-kinin system，KKS）调节人体血压。ACE抑制肽作为生物活性肽的一种，具有无毒副作用和对正常血压无影响的优点，长期服用可以达到预防、控制和辅助治疗高血压之目的[4]。现已成功从草鱼蛋白[2]、紫菜蛋白[3]、蛋清蛋白[4]、乳清蛋白[5]和麦胚蛋白[6]等食源蛋白中分离得到高活性的ACE抑制肽。

随着ACE抑制肽研究的深入，研究者发现贮存环境、加工工艺和胃肠道酶消化等因素能够导致ACE抑制肽的活性降低，甚至丧失[3，7]。 因而，开发ACE抑制肽时，除了具有较高的ACE抑制活性外，还要在生产、贮藏及体内消化吸收过程中具有较强的稳定性。目前，已有大量食源蛋白ACE抑制肽的稳定性被研究，如:紫菜源ACE抑制肽[3]和蛋清源ACE抑制肽[7]等。然而，有关蚕蛹源ACE抑制肽稳定性的研究尚未见报道。

本课题组在前期研究工作中利用酶解技术从蚕蛹蛋白中制备出了高活性ACE抑制肽[8]。在此基础上，作者对蚕蛹源ACE抑制肽的热稳定性、耐酸碱性和抗肠道酶消化能力等性能进行研究，同时，研究了蚕蛹源ACE抑制肽的抑制动力学和抑制后ACE的紫外光谱变化，为蚕蛹源ACE抑制肽的工业化生产和应用提供技术和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和原料 蚕蛹:由农业部蚕桑产品质量监督检验测试中心（镇江）提供。蚕蛹先用乙醚脱脂，50℃烘干后粉碎，过80目筛备用；胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶:均购自生工生物工程（上海）有限公司；碱性蛋白酶（alcalase）:购自诺维信（中国）生物技术有限公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）和血管紧张素转换酶（ACE）:购自 Sigma-Aldrich公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 Pellicon小型超滤系统:美国Millipore公司；UV-2100型分光光度计:尤尼柯（上海）仪器有限公司；UV-2450紫外吸收分光光度计:日本Shimadzu公司；SSY-H型恒温水浴锅:上海三申医疗器械有限公司；LR10-24A型离心机:北京雷勃尔有限公司；WH-2微型漩涡混合仪:上海沪西分析仪器厂；FDU-2100型冷冻干燥机:上海爱朗仪器有限公司；DC-1500喷雾干燥机:上海达程实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蚕蛹源ACE抑制肽的制备

1）蚕蛹蛋白的提取:取10 g蚕蛹粉，加入100 mL蒸馏水，用1 mol/L NaOH调节pH至8.0，在室温下搅拌1 h后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，然后用1 mol/L HCl将其pH调节至4.0，静置30 min后5 000 r/min离心10 min，收集沉淀，将沉淀透析48 h，然后冷冻干燥备用。

2）蚕蛹蛋白的酶解与超滤分离:将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成质量浓度为10 g/L悬浮液，在酶解温度50.8℃、酶解pH 9.0和加酶量3 500 U/g条件下，用Alcalase酶解120 min，酶解结束后在沸水浴中灭酶5 min，冷却至室温后，5 000 r/min离心10 min，收集上清液，将该上清液用截留相对分子质量为5 000的超滤膜进行分离，透过液即为蚕蛹源ACE抑制肽。

1.2.2 体外ACE抑制活性的测定 蚕蛹源ACE抑制肽的体外活性测定参照文献[9]报道的方法。将10 μL蚕蛹源ACE抑制肽与 10 μL ACE溶液（酶活力为0.1 U/mL，用pH 8.3的100 mmol/L硼酸钠缓冲溶液（含300 mmol/L NaCl）配制），在37℃下预热5 min， 加入 45 μL、5 mmol/L HHL 溶液 （用 pH 8.3的100 mmol/L硼酸钠缓冲溶液 （含300 mmol/L NaCl）配制），在37℃反应30 min，反应结束后立即加入 85 μL、1 mol/L HCl溶液终止反应；在反应液中加入1 mL乙酸乙酯，振荡2 min后，4 000 r/min离心10 min，取出800 μL有机相溶液转入玻璃管中，在100℃下蒸发30 min，蒸发后的残渣中加入800 μL双蒸水，混匀后在228 nm下测定吸光度（D228nm），每个样品重复3次。另以双蒸水代替酶解产物作为空白样品。按下式计算蚕蛹源ACE抑制肽的体外活性:

式中，I为ACE抑制率；A为空白组的吸光度；B为反应体系中没有加入ACE时的吸光度；C为反应体系中有ACE和蚕蛹源ACE抑制肽时的吸光度。

1.2.3 蚕蛹源ACE抑制肽的稳定性试验

1）热稳定试验:将蚕蛹源ACE抑制肽溶液（质量浓度0.72 mg/mL）的pH调节至7.0，分别在4、37、50、80℃处理不同时间，测定其ACE抑制活性。

2）酸、碱稳定性试验:将蚕蛹源ACE抑制肽溶液（质量浓度0.72 mg/mL）的pH值分别调节至2.0、5.0、7.0和10.0，在20℃放置不同时间，测定其ACE抑制活性。

3）干燥方式试验:将干燥的蚕蛹源ACE抑制肽在室温放置不同时间，然后将其配置成0.5 mg/mL溶液，测定ACE抑制活性。冷冻干燥:温度-85℃，真空度＜10 Pa；喷雾干燥:出风口温度100℃，进风口温度190℃，进料速度10 mL/min；热风干燥:温度55℃；真空干燥:温度45℃，真空度＜0.01 MPa。

4）体外消化试验:根据Wu等[10]报道的方法（略有修改）进行体外消化试验。取100 mL蚕蛹源ACE抑制肽溶液（质量浓度0.5 mg/mL），将其pH值调节至2.0后，加入胃蛋白酶（1 750 U/g），在37℃下保温2 h，然后将酶解溶液的pH调节至7.0，加入胰蛋白酶（2 500 U/g）和 α-胰凝乳蛋白酶（1 000 U/g），在37℃下保温4 h后，沸水灭酶10 min，取样测定ACE抑制率。

1.2.4 葡聚糖凝胶G-50色谱分析 用蒸馏水作为洗脱液，流速为 1 mL/min，上样量为 200 μL，凝胶柱规格为1.0 cm×30 cm，检测波长为220 nm。

1.2.5 蚕蛹源ACE抑制肽的抑制动力学试验 根据Barbana等[11]报道的方法研究蚕蛹源ACE抑制肽的抑制动力学。在不同马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）底物浓度下，测量ACE的活性，ACE的活性用 228 nm的吸光度（A228nm）表示，用 1/A228nm和 1/HHL作图评价蚕蛹源ACE抑制肽的抑制模式，并通过曲线的回归方程得到蚕蛹源ACE抑制肽的抑制常数Ki。

1.2.6 蚕蛹源ACE抑制肽与ACE作用的紫外光谱分析 在400 μL ACE溶液中迅速加入50 μL蚕蛹源ACE抑制肽，在37℃下分别测定0、10 min时的紫外光谱。扫描条件:样品池的光径为1 cm，在200～500 nm下用紫外分光光度计扫描。

2 结果与讨论

2.1 蚕蛹源ACE抑制肽的稳定性分析

2.1.1 温度对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响 不同温度对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响见图1。从图1可以看出，在4℃和37℃保存时，随着保存时间的延长，蚕蛹源ACE抑制肽的活性基本不变，在3 h时活性仍然保留初始时的92.2%以上；当保存温度为50℃时，随着保存时间的延长，蚕蛹源ACE抑制肽的活性缓慢降低，在3 h时活性为初始时的75.9%；当保存温度为80℃时，随着保存时间的延长，蚕蛹源ACE抑制肽的活性迅速降低，在3 h时活性为初始时的41.4%，这主要是因为高温加速了ACE抑制肽的裂解[12]。由此可以看出，蚕蛹源ACE抑制肽在低温下活性较稳定，而在高温下则活性丧失严重，这与已报道的紫菜源ACE抑制肽的热稳定性[3]基本一致。

图1 温度对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响Fig.1 Effects of temperature on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.1.2 pH对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响 不同pH对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响见图2。从图2可以看出，在pH 7条件下保存时，蚕蛹源ACE抑制肽的活性较稳定，保存3 h的活性为初始时的89.5%；当保存pH值为2、5、10时，蚕蛹源 ACE抑制肽的活性丧失较大，保存3 h后活性分别丧失了56.0%、46.4%和27.5%。试验结果表明，蚕蛹源ACE抑制肽在中性条件下稳定性较好，而在强酸和强碱条件下稳定性较差。这可能是因为强酸碱条件造成ACE抑制肽的肽链断裂，结构破坏，最终导致ACE抑制肽的活性降低[3]。

图2 pH对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响Fig.2 Effects of pH on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.1.3 干燥方式对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响干燥方式对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响见图3。

图3 干燥方式对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响Fig.3 Effects of drying methods on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

从图3可以看出，在4种干燥方式中，冷冻干燥对蚕蛹源ACE抑制肽的活性影响最小，干燥后蚕蛹源ACE抑制肽（0.5 mg/mL）的活性为71.3%；其次为喷雾干燥，干燥后蚕蛹源ACE抑制肽（0.5 mg/mL）的活性为64.6%，为冷冻干燥活性的90.5%；而热风干燥和真空干燥对蚕蛹源ACE抑制肽的活性影响较大，干燥后蚕蛹源ACE抑制肽的活性迅速下降，仅为冷冻干燥活性的42.3%和56.4%。此外，室温保存试验表明，冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥和热风干燥的ACE抑制肽均具有良好的稳定性，保存60 d后活性基本不变。由此可以看出，冷冻干燥和喷雾干燥是干燥ACE抑制肽的理想方法。然而，由于冷冻干燥存在干燥时间长、设备昂贵、能耗高等缺点，不宜用于工业化生产。因此，喷雾干燥是工业化干燥蚕蛹源ACE抑制肽的最佳选择。

2.1.4 肠道酶消化对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响 蚕蛹源ACE抑制肽经肠道消化后，其ACE抑制活性变化见表1。从表1可以看出，蚕蛹源ACE抑制肽经胃蛋白酶消化后，其活性显著降低 （P＜0.05），比消化前降低了13.1%，相似的现象也被发现在蛋清源ACE抑制肽的消化研究中。Miguel研究发现:胃蛋白酶能够引起蛋清源ACE抑制肽活性降低，使其IC50值比消化前提高了54.5%[13]。这可能是由于胃蛋白酶水解了部分ACE抑制肽，使其成为了失活片段，因而活性降低。然而，经胃蛋白酶消化的蚕蛹源ACE抑制肽进一步被胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶共同消化后，其活性反而显著提高（P＜0.05），比胃蛋白酶消化后的活性提高了8.2%。这可能是因为胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解后又产生了新的ACE抑制肽，该现象在麦胚源ACE抑制肽的体外消化试验中也被发现[14]。

表1 肠道酶消化对蚕蛹源ACE抑制肽活性的影响Table 1 Effects of intestinal enzyme degradation on activities of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

为了进一步研究肠道酶消化对蚕蛹源ACE 抑制肽活性的影响，分别对消化前、胃蛋白酶消化和胃蛋白酶+胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶消化的蚕蛹源ACE抑制肽进行葡聚糖凝胶层析分离，层析分离效果见图4。从图4可以看出，消化前和消化后均存在两个主要峰a和b。胃蛋白酶消化后，峰a的面积比消化前降低，而峰b的面积比消化前增加，这说明胃蛋白酶消化后，蚕蛹源ACE抑制肽向小相对分子质量转变；当进一步用胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶消化后，其峰a和b分别向右轻微移动，这说明胰蛋白酶+α-胰凝乳蛋白酶的消化使蚕蛹源ACE抑制肽的相对分子质量进一步变小。此结果说明，肠道酶消化降解了部分蚕蛹源ACE抑制肽，使其变成失活片段或新的ACE抑制肽，最终导致蚕蛹源ACE抑制肽在消化前后的活性发生了变化。

图4 蚕蛹源ACE抑制肽的葡聚糖凝胶G-50色谱图Fig.4 Sephadex G-50 chromatogram of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

2.2 蚕蛹源ACE抑制肽对ACE抑制动力学分析

利用Lineweaver-Burk双倒数作图法对蚕蛹源ACE抑制肽的抑制模式进行研究。蚕蛹源ACE抑制肽的ACE抑制曲线见图5。

图5 蚕蛹源ACE抑制肽的ACE抑制曲线Fig.5 ACE inhibition curves of the ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae

从图5可以看出，当蚕蛹源ACE抑制肽的质量浓 度 分 别 为 0、0.01、0.05 mg/mL 时 ， 它 们 的Lineweaver-Burk双倒数曲线相交于y轴，这说明蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的抑制模式是竞争性抑制[15]。这与已报道的草鱼源ACE抑制肽[2]、大豆源ACE抑制肽[10]和灰树花源ACE抑制肽[16]等的抑制模式相同。根据Lineweaver-Burk双倒数曲线的回归方程，得到蚕蛹源ACE抑制肽的抑制常数 （Ki）为0.06 mg/mL，远远高于降血压药物 Captopril的 Ki值（0.006 7 μg/mL）[17]，这表明蚕蛹源 ACE 抑制肽对ACE的抑制活性远低于Captopril。尽管蛹源ACE抑制肽的活性没有Captopril的高，但却远远高于绿豆源 ACE抑制肽 （Ki=0.31 mg/mL）[11]、 红扁豆源ACE抑制肽（Ki=0.46 mg/mL）[11]和油菜籽源 ACE抑制肽（Ki=0.2 mg/mL）[18]。

2.3 蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的紫外光谱影响

在蛋白质的紫外吸收光谱中，色氨酸和酪氨酸在280 nm波长附近有一个吸收峰；苯丙氨酸在257 nm波长附近有一个吸收峰[19]。蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的紫外光谱影响见图6。从图6可以看出，ACE与蚕蛹源ACE抑制肽相互作用30 min后，在240～280 nm附近的紫外吸光值发生明显的变化。与对照组（0 min）相比，相互作用30 min后，ACE的紫外吸光值在240～280 nm附近均明显升高。紫外光谱变化反映了蛋白质在溶液中的构象变化，紫外吸光度的增加说明蛋白质分子发生了伸展[19-20]。此结果初步说明，蚕蛹源ACE抑制肽能够改变ACE的分子结构，而这种结构变化是导致ACE的酶活降低甚至完全丧失的直接原因。

图6 蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的紫外光谱影响Fig.6 Effects of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae on ultraviolet spectrum of ACE

3 结语

蚕蛹源ACE抑制肽耐高温性能较差，在酸和碱环境中不稳定。冷冻干燥和喷雾干燥对蚕蛹源ACE抑制肽的活性影响较小；与其它干燥方式相比，喷雾干燥的效率最高，适宜工业化生产。此外，蚕蛹源ACE抑制肽具有较强的耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶消化的能力，经该3种消化酶处理后，蚕蛹源ACE抑制肽仍能保留初始活性的94.0%；蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的抑制模式为竞争性抑制，其抑制常数（Ki）为0.06 mg/mL，是一种活性较强的ACE抑制剂。蚕蛹源ACE抑制肽对ACE的紫外光谱有明显影响，使ACE在240～280 nm附近的紫外吸光值明显增加，初步揭示了蚕蛹源ACE抑制肽能够改变ACE的分子结构。

[1]Cushman D W，Cheung H S，Sabo E F，et al.Development and design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme[J].The American Journal of Cardiology，1982，49（6）:1390-1394.

[2]Chen J，Wang Y，Zhong Q，et al.Purification and characterization of a novel angiotensin-I converting enzyme （ACE） inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J].Peptides，2012，33（1）:52-58.

[3]何荣海，马海乐.条斑紫菜ACEI肽结构鉴定与性能试验[J].江苏大学学报:自然科学版，2012，33（4）:430-434.HE Rong-hai，MA Hai-le.Structure characterization and performance determination of Porphyra yezoensis ACEI peptides[J].Journal of Jiangsu University:Natural Science Edition，2012，33（4）:430-434.（in Chinese）

[4]Yu Z，Liu B，Zhao W，et al.Primary and secondary structure of novel ACE-inhibitory peptides from egg white protein[J].Food Chemistry，2012，133（2）:315-322.

[5]Pan D，Cao J，Guo H，et al.Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate[J].Food Chemistry，2012，130（1）:121-126.

[6]赵伟睿，马海乐，贾俊强，等.超声波对麦胚蛋白性质及其酶解物ACE抑制活性的影响[J].食品与生物技术学报，2010，29（2）:177-182.ZHAO Wei-rui，MA Hai-le，JIA Jun-qiang，et al.Effect of ultrasound treatment on the defatted wheat germ protein properties and its ACE inhibition activity[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（2）:177-182.（in Chinese）

[7]于志鹏，赵文竹，于一丁，等.蛋清蛋白质降压肽的化学及酶稳定性研究[J].食品科学，2010，31（9）:23-26.YU Zhi-peng，ZHAO Wen-zhu，YU Yi-ding，et al.Stability of antihypertensive peptides from egg white protein to chemicals and enzymes[J].Food Science，2010，31（9）:23-26.（in Chinese）

[8]贾俊强，徐金玲，吴琼英，等.酶解蚕蛹蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的工艺优化[J].蚕业科学，2011，37（5）:872-877.JIA Jun-qiang，XU Jin-ling，WU Qiong-ying，et al.Optimization of technology for preparation of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from silkworm pupal protein by enzymatic hydrolysis[J].Science of Sericulture，2011，37（5）:872-877.（in Chinese）

[9]Muguerza B，Ramos M，Sánchez E，et al.Antihypertensive activity of milk fermented by Enterococcus faecalis strains isolated from raw milk[J].International Dairy Journal，2006，16（1）:61-69.

[10]Wu J，Ding X.Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides[J].Food Research International，2002，35（4）:367-375.

[11]Barbana C，Boye，J I.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory properties of lentil protein hydrolysates:determination of the kinetics of inhibition[J].Food Chemistry，2011，127（1）:94-101.

[12]刘静波，于志鹏，赵文竹，等.蛋清源ACE抑制肽结构鉴定及其稳定性[J].吉林大学学报:工学版，2011，41（2）:579-584.LIU Jing-bo，YU Zhi-peng，ZHAO Wen-zhu，et al.Characterization and stability of ACE inhibitory peptides derived fromegg white protein[J].Journal of Jilin University:Engineering and Technology Edition，2011，41（2）:579-584.（in Chinese）

[13]Miguel M，Alonso M J，Salaices M，et al.Antihypertensive，ACE-inhibitory and vasodilator properties of an egg white hydrolysate:effect of a simulated intestinal digestion[J].Food Chemistry，2007，104（1）:163-168.

[14]Matsui T，Li C H，Tanaka T，et al.Depressor effect of wheat germ hydrolysate and its novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide，Ile-Val-Tyr，and the metabolism in rat and human plasma[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin，2000，23（4）:427-431.

[15]Quirós A，Contreras M M，Ramos M，et al.Stability to gastrointestinal enzymes and structure–activity relationship of β-caseinpeptides with antihypertensive properties[J].Peptides，2009，30（10）:1848-1853.

[16]Choi H S，Cho H Y，Yang H C，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa[J].Food Research International，2001，34（2-3）:177-182.

[17]Tsai J，Chen T，Sun Pan B，et al.Antihypertensive effect of bioactive peptides produced by protease-facilitated lactic acid fermentation of milk[J].Food Chemistry，2008，106（2）:552-558.

[18]Makinen S，Johannson T，Gerd E V，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory and antioxidant properties of rapeseed hydrolysates[J].Journal of Functional Foods，2012，4（3）:575-583.

[19]吴丹，徐桂英.光谱法研究蛋白质与表面活性剂的相互作用[J].物理化学学报，2006，22（2）:254-260.WU Dan，XU Gui-ying.Study on protein-surfactant interaction by spectroscopic methods[J].Acta Physico-Chimica Sinica，2006，22（2）:254-260.（in Chinese）

[20]Tang C，Yang X，Chen Z，et al.Physicochemical and structural characteristics of sodium caseinate biopolymers induced by microbial transglutaminase[J].Journal of Food Biochemistry，2005，29（4）:402-421.