青蒿酯对房颤大鼠心肌核转录因子-κB表达的干预作用

焦华琛 张蕴慧 李运伦

核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NFκB)是一种多效可诱导的转录因子，除了能够调节多种基因的表达、产生细胞因子，还能调节多种炎症因子的表达和细胞凋亡。NF-κB 对免疫应答、炎症反应、细胞分化和生长、细胞粘附和细胞凋亡所必需的多种细胞因子、粘附因子具有调节作用。前期多项研究表明:炎症因子NF-κB 在心血管疾病的发生过程中具有重要的意义。同时，NF-κB 在肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)的产生中也起重要作用。为观察NF-κB 与房颤发生的关系，笔者进行了以下实验:

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

SD 大鼠40 只，体重(250 ±20)g 左右，由山东大学实验动物中心提供，合格证号3CX1〈鲁〉2009001。卡托普利由广州白云山制药厂生产，批号110754。青蒿酯由西安小草植物科技有限责任公司生产，批号SC101213。戊巴比妥钠由上海华蓝化学科技有限公司进口分装，批号57330。RIPA 裂解液由碧云天生物技术研究所提供，批号P0013B。Trizol 试剂盒由生工生物工程(上海)有限公司生产，批号1102111W。

1.2 动物模型建立及分组

SD 大鼠按数字随机表法分为空白对照组10只，模型组10 只、青蒿酯组10 只、卡托普利组10只，采用氯化钙、乙酰胆碱混合液以舌下静脉给药的方式建立房颤动物模型。用1%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，先描记大鼠正常心电图。舌下静脉注射氯化钙、乙酰胆碱混合液1 mL·kg-1，描记心电图，待出现典型房颤f 波。模型组、青蒿酯组、卡托普利组的30 只大鼠均按此方法每日给药，常规喂养，连续给药4 周，停药后心电图仍有典型房颤改变为造模成功。3 组各有9 只大鼠造模成功。实验前2 周青蒿酯组以1.25 g 生药/kg 灌胃。卡托普利组以3.25 mg/kg 灌胃。空白对照组实验结束时为9 只。

1.3 PCR 引物设计［2］

选用肌动蛋白-β(β-actin)作为内参照。Trizol法提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA 纯度及含量。引物序列如下:NF-κB:正向 5'-TCTGAGACTCCGTGAAA-3'，反向 5'-CAGACTGACTTTATGGGAAC-3'。52℃退火，循环30 次，扩增片段285 bp。β-actin:5'-GCTGTCCCTGTACGCCTCTG-3'，反向5'-GCTTCTCCTTGATGTCCCGC-3'。59℃退火，循环30 次，扩增片段230 bp。用分光光度计测定吸光度，换算成mRNA 浓度。

1.4 Western-blot 法检测NF-κB 表达

实验当日处死动物，取左心房组织［1］，制成匀浆，使用RIPA 裂解液，再加入100 mg/L 蛋白酶抑制剂提取组织蛋白，并测定蛋白浓度。制作12%的分离胶和5%的积层胶，电泳结束后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭3 小时，加入一抗，4℃孵育过夜，TBS-T 溶液洗膜4次，每次15 分钟。室温下加二抗孵育2 小时，洗膜4 次，用增强化学发光法显色，凝胶成像分析系统摄像分析并得出灰度值。

1.5 统计学分析

使用SPSS 16.0 统计软件进行统计处理。NFκB 表达以灰度值统计，NF-κB mRNA 表达计量资料以表示，两组间比较采用t 检验，组间比较采用单因素方差分析。P ＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 房颤大鼠心肌NF-κB mRNA 表达结果显示:模型组与对照组采用t 检验进行分析，在NF-κB mRNA 表达方面相比P ＜0.05(P =0.024)，证明房颤大鼠心肌中NF-κB mRNA 的表达较正常大鼠明显增加。青蒿酯组与模型组采用t 检验分析，两组相比P ＜0.05(P =0.018)，说明青蒿提取物可明显降低炎症因子NF-κB mRNA 的表达，卡托普利与模型组采用t 检验分析，两组相比P ＞0.05(P =0.061)，即说明卡托普利对该因子的表达没有影响。

表1 各组大鼠心肌NF-κB mRNA 的表达(±s)

表1 各组大鼠心肌NF-κB mRNA 的表达(±s)

注:与对照组相比，aP ＜0.05;与模型组相比bP ＜0.05;与模型组相比cP ＞0.05

模型组对照组青蒿组卡托普利组NF-κB 0.92 ±0.08a 0.23 ±0.10 0.36 ±0.08b 0.91 ±0.07 c

2.2 Western-blot 法检测房颤大鼠心肌NF-κB 表达

正常情况下，大鼠心肌中有一定NF-κB 表达，在本实验中，对照组NF-κB 表达的灰度值是最低的，青蒿酯组次之，模型组最高。灰度值越低，蛋白表达的水平越高。因此可以得出结论:房颤发生后，心肌NF-κB 的表达明显增强。四组间经单因素方差分析，证明青蒿酯能够有效降低炎症因子NFκB 的表达(P =0.034，P ＜0.05)，而卡托普利对NF-κB 没有影响(P =0.067，P ＞0.05)。蛋白表达及灰度值直方图见图1、2。

图1 房颤大鼠心肌细胞NF-κB 蛋白的表达

图2 房颤大鼠心肌细胞NF-κB 表达灰度值统计结果(n=9)

3 讨论

NF-κB 与动脉粥样硬化、心衰、缺血再灌注等心血管疾病有密切的联系。NF-κB 是一种重要的基因转录调节分子，它可与多种蛋白质基因启动子或增强子的κB 序列特异结合，诱导基因表达增强。NFκB 是由p50 和p65 两个蛋白亚基组成，是炎症反应的中枢调节物［3］。NF-κB 激活通路广泛存在于内皮细胞、平滑肌细胞及心肌细胞中。NF-κB 是1986年从B 淋巴细胞核中检测到的一种核蛋白因子，它能与免疫球蛋白κ 的轻链基因增强子κB 序列特异性地结合，故称为NF-κB［4］。

NF-κB 是TGF-β 的上游调控因子。活化的NFκB 进入细胞核后能够促进靶基因转录，可高效诱导多种成分的表达:(1)细胞因子，如TGF-β、IL-6 等;(2)黏附分子，如ICAM-1、VCAM-1 等;(3)趋化因子;(4)急性反应蛋白;(5)调控炎症反应放大与延续的酶［5］。

NF-κB 与心律失常关系密切。前期研究已经发现，房颤大鼠心肌TNF-α 的表达是上调的，青蒿酯与卡托普利均能减低TNF-α 的表达。NF-κB 是TNF-α 的上游调节因子。本研究在既往研究的基础上以青蒿酯作为研究对象，观察青蒿酯对房颤大鼠心肌中NF-κB 表达的干预作用。

本研究发现:正常大鼠心肌中有少量NF-κB 表达，房颤发生后，心肌NF-κB mRNA 的表达明显增强。青蒿酯能够有效降低炎症因子NF-κB mRNA的表达(P ＜0.05)，而卡托普利对NF-κB mRNA 没有影响(P ＞0.05)。Westing-blot 法的结果证明这证明青蒿提取物降低TNF-α 是通过干预NF-κB 表达实现的，而卡托普利并非通过这一途径实现的。

［1］ 姜楠，梁晓春，屈岭，等.筋脉通胶囊对糖尿病大鼠坐骨神经形态测量学及核转录因子κB 蛋白表达的影响［J］.环球中医药，2012，5(2):100-104.

［2］ 赵凯，钱月慧，程晓东.TNF-α、NF-κB 在动脉粥样硬化闭塞症兔动脉中的表达变化［J］.宁夏医科大学学报，2012，34(1):14-16.

［3］ 陈志成，陈国忠，吴晓智，等.上胸段硬膜外阻滞对蛛网膜下隙出血兔基底动脉NF-κB 和COX-2 表达的影响［J］. 医学综述，2012，18(14):2279-2282.

［4］ 李恩，刘宗芳，孙利强，等.CT-1、NF-κB 在心肌梗死大鼠心室重塑中的表达及罗格列酮的作用［J］.西安交通大学学报(医学版)，2011，32(1):54-56，92.

［5］ Siebenlist U，Franzoso G，Brown K，et al.Structure，regulation and function of NF-κB［J］. Annu Rev Cell Biol，1994，10:405-455.