罗布麻总黄酮对大鼠脑缺血损伤的保护作用

庄鲁江 孙江兵 周军

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻的干燥叶，罗布麻叶营养丰富，富含羽扇豆醇、金丝桃苷、三叶豆苷、多种氨基酸、多糖、维生素等成分。其中黄酮类物质为罗布麻叶主要的有效部位，近几年研究表明罗布麻叶总黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗血栓、抗肿瘤、降血脂、抗辐射和促进学习记忆等作用［1-4］。本实验研究罗布麻叶总黄酮对脑缺血再灌注大鼠的保护作用，为进一步开发和利用罗布麻叶这一中药资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性Wistar 大鼠，体重280～320g，(兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物中心，动物合格证号:SYXK 均2007-023)。于清洁级鼠类实验室饲养，采用标准大鼠饲料喂食，自由摄食与饮水，室温调节于25℃左右。

1.2 试药

罗布麻叶总黄酮(兰州军区乌鲁木齐总医院自制，总黄酮含量为85%)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测试盒(南京建成生物工程研究所)，其余试剂均为分析纯级。

1.3 仪器

BP210S 电子天平(赛多利斯公司);UV-1800PC紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司);DGSY 电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂);CP100WX 超速冷冻离心机(日本日立公司);SK5200LHC 超声处理器(上海科导超声仪器有限公司);RE-3000C 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);光学显微镜(日本OLYMPUS)。

1.4 分组及给药

将45 只Wistar 大鼠按随机数字表法分为5组，即假手术组、脑缺血再灌注模型组、罗布麻总黄酮(20、40、80 mg/kg)剂量组。给药组动物先连续灌胃给药5 天，每天一次。模型组给予等量的生理氯化钠溶液(10 ml/kg)灌胃5 天，每天一次。第5 天给药1 小时后施行手术，根据Longa 等报道的方法，建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型［5-6］。

1.5 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型制备

大鼠7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA 与CCA，用动脉夹夹闭ICA 远心端后，迅速于距ECA 与ICA 分叉处约0.5 cm 的颈总动脉处作一切口，插入一端涂有石蜡的尼龙线(直径为0.28 mm)，插入深度为(18.5 ±0.5)mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留约1 cm，缝合皮肤。2小时后轻轻向外提拉所留线头至略有阻力以实现大脑中动脉再灌注。在缺血2 小时和再灌注0.5 小时内用电热毯维持大鼠肛温在36.5～37.5℃。假手术与其他模型鼠一样分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，但只结扎CCA。模型成功按以下标准:(1)大鼠左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失;(2)提尾倒悬时左上肢向胸前屈曲;(3)行走时左侧倾倒或向左转圈;(4)右侧出现霍纳氏征(Honer's)。

1.6 取材

取造模成功的动物，用3.5%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，剪开胸腔暴露心脏，剪开心包膜，用恒流泵经过心脏灌注生理盐水约200 ml，4%多聚甲醛缓冲固定液300 ml，之后立刻断头取脑，放入-4℃含4%多聚甲醛缓冲固定液40 分钟，70%酒精固定，随后梯度酒精脱水、石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚8 μm)。

1.7 HE 染色

将石蜡切片制作的标本，进行常规HE 染色，程序如下:石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染;切片置苏木素染液5 分钟，自来水洗去多余的染料;切片放入盐酸酒精中数秒钟，水洗;切片入氨水溶液中至细胞核变蓝;将返蓝的切片充分水洗，去掉碱性物质，然后入1%伊红水溶液中5 分钟，洗去多余的伊红;显微镜下观察核浆染色对比清晰后梯度酒精脱水、封片。光镜下观察大鼠脑组织病理学变化。

1.8 生化指标测定

脑缺血2 小时再灌注24 小时断头，于冰盘上取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，去除嗅球与低位脑干，称重后，以生理盐水1 ∶9 在冰水浴中匀浆制成10%脑组织匀浆，分装，低温冰箱冻存备用。取出匀浆化冻后按各测定指标要求处理得上清夜，按照试剂盒说明书所示方法分别测定上清夜中MDA 含量、CAT 含量、SOD 活性、GSH-Px 活性。以牛血清蛋白为标准品，用考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白质含量。

1.9 统计学处理

采用SPSS 10.0 统计软件对数据资料进行分析处理，所有计量数据均使用均数±标准差表示，多组间数据采用单因素方差(One-Way ANOVA)检验，两两比较采用SNK-q 检验。P ＜0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织病理形态学变化

光镜下，假手术组神经细胞形态无异常，胞膜、核膜清晰，核仁明显。脑缺血再灌注模型组神经细胞出现水肿样改变，细胞间隙增宽，缺血脑组织舒松，空泡样变明显，胞体皱缩呈三角形，核固缩或溶解;中心区神经元脱失明显，残存细胞多无完整的细胞结构。在罗布麻叶总黄酮各剂量组神经细胞仅有轻、中度缺血性改变，细胞肿胀程度、间隙及胞核改变均较对照组轻。缺血中心区神经元脱失现象明显减轻，周边区皮层细胞的形态接近正常，并呈剂量依赖性。见图1。

2.2 CAT、SOD、GSH 和MDA 测试结果

脑缺血再灌注模型组CAT、SOD 和GSH 活性明显低于假手术组，MDA 含量明显高于假手术组，经SNK-q 检验比较差异具有统计数意义［q 值分别为5.78、4.23、5.64、4.97 均＞q0.05 (2.89)，P ＜0.05］。罗布麻叶总黄酮各剂量组脑组织CAT、SOD、GSH 活性和MDA 含量与假手术组经SNK-q 检验比较差异无统计数意义［比较CAT，q值分别为2.01(80 mg/kg 组)，2.15(40 mg/kg 组)，2.37(20 mg/kg 组);比较SOD，q 值分别为1.24(80 mg/kg 组)，1.65(40 mg/kg 组)，1.98(20 mg/kg组);比较GSH，q 值分别为1.73(80 mg/kg 组)，2.06(40 mg/kg 组)，2.24(20 mg/kg 组);比较MDA，q 值分别为1.59(80 mg/kg 组)，1.82(40 mg/kg 组)，2.01(20 mg/kg 组)均＜q0.05(2.89)，P ＞0.05］。罗布麻叶总黄酮各剂量组脑组织CAT、SOD、GSH活性和MDA 含量与脑缺血再灌注模型组经SNK-q检验比较差异具有统计数意义［比较CAT，q 值分别为5.36(80 mg/kg 组)，5.06(40 mg/kg 组)，4.51(20 mg/kg 组);比较SOD，q 值分别为4.01(80 mg/kg 组)，3.55(40 mg/kg 组)，3.19(20 mg/kg组);比较GSH，q 值分别为5.21(80 mg/kg 组)，4.77(40 mg/kg 组)，4.23(20 mg/kg 组);比较MDA，q 值分别为4.51(80 mg/kg 组)，4.23(40 mg/kg组)，3.89(20 mg/kg 组)均＞q0.05(2.89)，P ＜0.05］。见表1。

图1 罗布麻叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤的脑组织病理改变的影响(HE ×400)

表1 罗布麻叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤后MDA、CAT、SOD 和GSH-Px 活性的影响(n=8，±s)

表1 罗布麻叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤后MDA、CAT、SOD 和GSH-Px 活性的影响(n=8，±s)

注:与假手术组比较aP ＜0.05;与模型组比较bP ＜0.05

组别MDA(mg/mL)CAT(U/mg)SOD(U/mg)GSH-Px(mg/g)假手术组1.37 ±0.411.56 ±0.68223.18 ±20.1212.37 ±2.27脑缺血再灌注模型组2.31 ±0.53a0.51 ±0.49a179.27 ±21.04a6.64 ±2.48a总黄酮80 mg/kg 组1.41 ±0.89b1.59 ±0.84b227.43 ±47.67b12.78 ±2.28b总黄酮40 mg/kg 组1.68 ±0.62b1.35 ±0.59b209.57 ±31.31b10.04 ±2.64b总黄酮20 mg/kg 组2.02 ±0.47b1.08 ±0.73b191.34 ±22.43b7.27 ±3.04 b

3 讨论

黄酮类化合物是一类广泛分布于自然界的重要天然有机化合物。许多植物体内都含有黄酮类化合物，其对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病等方面起着重要的作用。近年的研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性，如降低血管脆性及异常的通透性，扩冠、抗血小板凝集、抗心律失常、抗自由基氧化、抗炎镇痛和保肝等作用。随着对中药研究的不断扩大和深入，发现一些黄酮类化合物具有防治脑缺血病的作用［7-9］。

罗布麻叶总黄酮是从夹竹桃科罗布麻属罗布麻的干燥叶中所提取的活性部位，主要成分有金丝桃苷、芦丁、槲皮素、芸香甙、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、异槲皮苷-6’-O-乙酰基、三叶豆苷-6’-O-乙酰基等，其中以金丝桃苷含量最高。近年来研究表明，槲皮素和金丝桃苷等成分具有抗脑缺血的作用［10-12］，但是罗布麻叶总黄酮对脑缺血的影响尚未见报道。本实验通过罗布麻叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤保护作用的研究，发现罗布麻叶总黄酮各剂量组均能减轻缺血/再灌注所致大鼠脑组织的病理变化，能抑制脑神经细胞水肿、溶解、细胞核模糊和固缩等，其中以高剂量组(80 mg/kg)效果最好。同时，本研究观察到，大鼠脑组织缺血2 小时，再灌注24 小时后，组织中氧化性指标MDA 含量明显增加，而抗氧化酶CAT、SOD 和GSH-Px 活力明显降低。与模型组比较，罗布麻叶总黄酮各剂量均能不同程度提高脑缺血/再灌注损伤时脑组织中的CAT、SOD 和GSH-Px 活性，以及降低MDA 含量，表现出良好的抗氧化作用。提示罗布麻叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤有显著保护作用，其保护作用与罗布麻叶总黄酮能降低脑内氧自由基水平、控制脂质过氧化程度有关。本研究为罗布麻叶总黄酮进一步用于脑缺血疾病的救治提供了可靠的实验依据。

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