肝动脉化疗栓塞术对肝细胞癌组织中缺氧诱导因子1α 及Foxp3 表达的影响及意义

宋浩 于友涛 何东风 李倩

宋浩, 于友涛, 何东风, 等. 肝动脉化疗栓塞术对肝细胞癌组织中缺氧诱导因子1α 及Foxp3 表达的影响及意义[J/CD].中华介入放射学电子杂志, 2013, 1(2): 78-81.

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）起病隐匿，进展快。很多患者就诊时已经是癌症晚期，错过了手术治疗的机会。经导管肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）是非手术治疗的首选方法，其近期效果得到了普遍的认可，并且为部分患者争取到根治性治疗的机会，但是远期疗效并不令人满意[1]。恶性肿瘤的发生原因之一是肿瘤细胞逃避免疫监视，CD4+CD25+调节性T 细胞（Treg）在免疫耐受中影响免疫系统对肿瘤抗原的应答，影响肿瘤的发生发展[2]。而Foxp3是CD4+CD25+Treg 发育和功能的决定因素，是CD4+CD25+Treg 的特异标志[3]。同时，有相关文献指出局部缺氧能促进Foxp3 的表达，并且被认为是缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）起着重要的作用[4-5]。本研究的目的是探讨经过TACE 治疗后的肝细胞癌残癌组织中HIF -1α 对肿瘤局部免疫微环境的影响，为改善肿瘤预后提供新的思路。

材料与方法

一、材料

收集2002 年1 月—4 月，哈尔滨医科大学附属第三医院介入科行TACE 术后Ⅱ期手术切除的HCC 患者组织标本31 例（TACE 治疗组）。选取同期未经过任何治疗直接行手术切除HCC 患者的组织标本37 例（单纯手术组）。TACE 治疗组患者手术前接受1～4 次的TACE 治疗，其中19例≤2 次，5 例＞2 次，平均1.7 次/例。TACE术中药物及栓塞材料包括表柔比星20～40 mg、丝裂霉素10～20 mg、羟喜树碱5～20 mg、氟尿苷250～1000 mg、碘油10～30 ml、明胶海绵碎屑。末次TACE 到Ⅱ期手术切除间隔时间为13～226 d，平均22.1 d。两组患者在年龄、性别、有无肝硬化病史、病灶大小、病灶数目、AFP 值及肝功能Child-Pugh分级方面差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

二、方法

1.检测方法

（1）主要试剂：HIF-1α 单克隆抗体（型号ZM-0342）、兔抗人Foxp3 单克隆抗体（型号ZM-0436）、抗兔免疫组化SP 试剂盒（编号SP-9001）、DAB 显色试剂盒（编号ZLI-9017）、APES 防脱片剂（编号ZLI-9003）、PBS 缓冲液（编号ZLI-9063），均购自北京中杉金桥生物公司。

（2）切片准备：每个肝癌组织蜡块标本厚4 μm，连续切片3 张。

（3）免疫组织化学染色：用过氧化物酶标记的联酶卵白素染色法（SP 法），常规脱蜡水化，组织抗原高压蒸汽修复。PBS 清洗后滴加一抗（用来检测HIF-1α 的组织切片滴加一抗前需经10%山羊血清封闭）。于4℃冰箱中过夜后，置室温下20 min，冲洗，DAB 染色，苏木精复染。封存固定。每组用已知阳性作对照，以PBS 代替一抗做阴性对照。

2.结果分析：光镜下HIF-1α 以细胞质或细胞核有棕黄色颗粒为阳性染色。高倍镜（×200）下分别选取阳性染色最明显的5 个视野，每个视野统计200 个细胞，共1 000 个细胞。计算每张切片阳性细胞百分率，分4 级：≤10%为0，11%～25%为＋，26%～50%为＋＋，＞50%为＋＋＋。本研究规定切片阳性细胞百分率≤25%为阴性。Foxp3蛋白表达为蓝紫色颗粒。以Foxp3+淋巴细胞数量作为组织中Treg 数量。每张切片取5 个高倍视野（×400），定性标准参照HIF-1α 的定性办法。

3. 统计学分析方法：使用SPSS 13.0 统计学软件包进行数据分析，采用χ2检验（必要时使用Fisher 精确概率检测法）。计量资料以±s表示；HIF-1α、Foxp3 的相关性分析采用Spearman 等级相关检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、两组标本HIF-1α 蛋白及Foxp3 表达情况（表1，图1、2）

TACE 治疗组肝癌组织标本中HIF-1α 蛋白表达阳性率平均为90.3%，较单纯手术组（6.6%）高，两组差异有统计学意义（χ2=6.785，P＜0.05）。TACE 治疗组肝癌组织标本中Foxp3 蛋白表达平均为87.3%，高于单纯手术组（65.4%），两组差异有统计学意义（χ2=6.399，P＜0.05）。

表1 两组肝细胞癌患者HIF-1α 和Foxp3 表达的比较[例数，百分率（%）]

二、TACE 治疗组残癌组织中HIF-1α 与Foxp3蛋白阳性表达的相关情况

在TACE 治疗组中，HIF-1α 蛋白阳性表达与Foxp3 蛋白阳性表达水平呈正相关（r=0.537，P=0.006）。

图1 TACE 组术后残癌组织（A）及单纯手术组切除肝细胞组织（B）HIF-1α 蛋白表达（SP，×400）图2 TACE 组术后残癌组织（A）及单纯手术组切除肝细胞组织（B）Foxp3 表达（SP，×400）

讨 论

杨秀华等[6]研究发现，肿瘤周围肝组织中CD4+CD25+Treg含量明显高于肿瘤及正常肝脏组织，并且随着CD4+CD25+Treg 的增加，CD8+T 淋巴细胞出现减少的趋势。Treg 能够通过抑制CD8+T 细胞对白细胞介素2 基因的转录和表达，来抑制T 淋巴细胞的活化与增殖，从而使局部微环境呈免疫抑制状态。而且这种抑制作用是通过细胞的直接接触或细胞因子而作用，促进了肿瘤的发生、发展，与预后成负性相关[7]。Jones 等[8]采用anti-CD25mAb去除调节性淋巴细胞以抑制恶性黑色素瘤生长，证明CD4+CD25+Treg 在人类肿瘤微环境下通过对CD8+T 淋巴细胞的抑制参与了肿瘤的免疫抑制，通过去CD4+CD25+Treg，可以解除其对免疫细胞的抑制作用。

肿瘤内各种炎性细胞相互作用可促进恶性肿瘤的进展。TACE 可造成肿瘤细胞缺血、缺氧致坏死，同时也增加了局部肿瘤组织炎性介质的释放。在治疗HCC 的同时，TACE 对机体免疫功能的影响不容忽视[9]。至于对Treg 的鉴定，Foxp3 得到了较多的认可。郑启昌等[10]研究发现Foxp3 蛋白在肿瘤组织中的表达与CD4+CD25+Treg 变化相平行，并且是其发育和功能的决定因素，被认为是CD4+CD25+Treg 的特异标志[3]。在试验中，通过用免疫组织化学法检测TACE 术后Ⅱ期切除残癌组织，显示TACE 治疗组Foxp3 表达高于单纯手术组（P＜0.05）。所以，这可能是造成TACE 治疗HCC 远期效果不令人满意的原因之一。而Xiong等[11]在对TACE 术前、术后外周血中的Treg 进行比较分析时，发现TACE 术前、术后患者外周血中Treg 均高于健康人，但差异无统计学意义，这可能是由于TACE 所致肿瘤局部缺氧而Treg 在局部增多，由于血流的阻断，不能与外周血沟通，从而对外周血中的Treg 影响较小。但项研究同时指出，TACE 术后1 个月的血中Treg 水平可以对HCC 预后进行判断，这可能是由于新生血管形成，使局部CD4+CD25+Foxp3+Treg 部分释放至外周血。而本试验中TACE 术后再行切除手术的间隔时间平均为22.1 d。所以这两项研究结果并不矛盾。

由此可见，Treg 对肿瘤的发生发展有着重要的影响，是判断HCC 患者预后的独立因素。目前对Foxp3 及Treg 高表达原因的研究较少。陈瑞清等[12]用线栓大鼠大脑中动脉的方法进行研究，发现脑缺血大鼠外周血中表达CD4+CD25+Treg，并且脑组织中也有Foxp3 的表达。而对照组（假手术组）的大鼠大脑中无Foxp3 表达，即便在手术组的大鼠中，未缺血侧也仅有少量Foxp3 表达。这说明缺血是Foxp3 及CD4+CD25+Treg 始动因素之一。缺血必然伴随着局部组织缺氧，而在实体肿瘤中，缺血缺氧是一个普遍存在的现象。肿瘤局部组织在缺氧环境下，细胞内缺氧反应基因的转录和表达发生了改变，TACE 无疑使肿瘤局部微环境中的氧含量进一步降低。

HIF-1 是调节细胞缺氧的一个重要因子，主要由HIF-1α 和HIF-1β 两种亚基组成。在含氧量正常的组织中，因为组织可降解HIF-1α，HIF-1α维持在一个较低的水平；而组织缺氧可破坏这种机制，使HIF-1α 的降解便受到影响，导致组织中HIF-1α 的含量提高。HIF-1α 是主要的氧调节亚基，介导缺氧反应元件的调控，使得缺氧反应元件的转录增强，表达产物增多，可产生多种生物学效应。并且HIF-1α 对免疫微环境的影响，已经有过相关报道。但是多为体外细胞培养及动物实验中证实。Ben-Shoshan 等[13]用体外培养细胞的方法研究发现，HIF-1α 可以通过激活和促使Treg 增殖，来促使局部免疫抑制的形成。在T 细胞中，HIF-1α 可以负向调节小鼠CD4+和CD8+T 细胞，敲除HIF-1α基因小鼠的T 细胞明显呈增殖状态[14]，这说明HIF-1α 是造成免疫抑制的因素之一，但具体机制尚未阐述。前文述及Treg 细胞也能够抑制CD4+和CD8+T 淋巴细胞的活化与增殖，而这两种抑制作用是否直接关联鲜见报道。本试验结果显示，TACE治疗组HIF-1α 及Foxp3 均高于单纯手术治疗组（P ＜0.05）。并且TACE 治疗组HIF-1α 与Foxp3表达水平呈正相关。这一结果为上述两种免疫抑制作用之间建立了部分联系。

综上所述，TACE 在栓塞HCC 供血动脉使其缺血坏死、限制肿瘤生长的同时，肿瘤局部微环境也发生了十分复杂的变化，促使多种因子表达水平上调[15]，也使局部病灶HIF-1α 及Foxp3 的表达水平上调，促进了CD4+CD25+Treg 细胞的增殖与活化，抑制免疫细胞对肿瘤的监视、清除、抑制等作用，从而影响肿瘤的发生与发展。针对HIF-1α 及Foxp3 的靶点药物结合介入治疗可能改善TACE 术的预后，为HCC 以TACE 为主的综合治疗提供了新的思路。

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