联合抑制Notch和PI3K/Akt 通路对胃癌细胞增殖的影响

李金鹏，于红刚

武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060

Notch 是一条在进化过程中高度保守的信号通路，参与多种细胞内分子生物学过程，如细胞周期转变、分化、增殖、血管生成和上皮细胞间叶样转变等［1］。磷酸肌醇3/激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路在多种癌细胞中呈现高表达，蛋白激酶B (Akt)的活化位于PI3K 超家族信号转导过程中的下游，主要负责由PI3K 始动的生物信息的传导，处于这一通路的中心环节［2］。研究发现Notch 通路和PI3K/Akt 通路存在着相互作用，共同参与细胞的分子生物学行为［3-5］。本实验通过应用上述两个信号通路的特异性抑制剂GSI和LY294002 来探讨其在胃癌细胞系SGC-7901中的作用及影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:胃癌SGC-7901 细胞系由消化疾病湖北省重点实验室传代保存。

1.1.2 试剂:RPMI-1640 培养基购自美国GIBCO 生物技术公司;磷酸化Akt 抗体、Notch-1 抗体以及相关二抗试剂盒均为CST 公司进口原装产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和抑制剂GSI 均购自美国的Sigma 公司;LY294002 来源于美国的Alex 公司;提取总蛋白试剂盒及Western blotting 所需的其他试剂来源于碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:传代培养胃癌SGC-7901 细胞于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养液中。6%CO2浓度、37℃培养环境下培养。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖:用含10%胎小牛血清的培养液将贴壁细胞配成单个细胞悬液，浓度为10 000～20 000/ml，每孔体积200μl 细胞接种到96 孔板，细胞贴壁后即加药。每种处理设5个复孔，对照组(不加药物处理)、LY294002组、GSI组、联合处理组共20个实验孔。LY294002 2 mg/ml(该浓度参考相关文献［2］)，每5个孔加10μl，GSI 20 mg/ml(该浓度参考相关文献［6］)，每5个孔加1μl。联合组药物用量同单用组。药物均混匀于无血清培养基后再加入到相应孔中。作用24 h 后，每孔加MTT［3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐］溶液(5 mg/ml 用PBS 配制，pH=7.4)10μl 继续孵育4 h 后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分融解。选择OD490 nm波长在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果并计算细胞抑制率=(空白组吸光度值均值－各浓度组吸光度值均值/空白组吸光度值均值)×100%，并绘制直方图。实验重复3次。

1.2.3 六孔板加药处理:对照组设1个孔，实验组LY294002(2 mg/ml)10μl 处理2个孔，GSI(20 mg/ml)1μl 处理1个孔和两者联合(同上浓度同体积)处理2个孔。以细胞长至80%～90%孔域并处于对数生长期开始加药，作用24 h 后提取各组总蛋白，行Western blotting 检测各组磷酸化的Akt和Notch-1 水平(以β-Actin 蛋白为内参对照)。步骤包括提取并测定总蛋白浓度、计算20μg 体积下的上样量、蛋白电泳、纤维膜电转和X 光胶片显影等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料两组间比较采用配对t 检验，多组间比较用方差分析，计数资料采用等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制剂作用后可抑制癌细胞的增殖 Notch和PI3K/Akt 两条信号通路的抑制剂GSI和LY294002 均能抑制胃癌SGC-7901 细胞的增殖，抑制增殖率分别为(53.56±2.04)%和(42.93±1.64)%，且二者联合应用癌细胞的增殖率降低更明显，为(86.01±2.02)%(见图1)。GSI和LY294002 单独处理组分别与抑制剂联合处理组抑制率的两两配对t 检验，得出tGSI=－41.12 (P=0.00)、tLY294002=－89.72 (P=0.00)。

图1 各处理组胃癌细胞增殖抑制率Fig 1 Cells proliferation inhibition rate of each treated group

2.2 抑制剂作用后可降低Notch-1和p-Akt的表达水平 Notch 信号通路的抑制剂GSI 能降低蛋白Notch-1的表达水平，而p-Akt的表达水平则较对照组增加;PI3K/Akt 通路的抑制剂LY294002 能降低p-Akt的表达水平，Notch-1 水平则无明显变化;两种信号通路的抑制剂联合应用后，p-Akt和Notch-1 蛋白的表达水平均降低(见图2)。

图2 抑制剂作用后Notch-1和p-Akt的表达水平 A:GSI可降低Notch-1的表达水平;B:LY294002可降低p-Akt的表达水平;C:抑制剂联合处理后可同时降低Notch-1和p-Akt的表达Fig 2 Expression level of Notch-1 and p-Akt after treated by inhibitors A:GSI could reduce the expression of Notch-1;B:LY294002 could reduce the expression level of p-Akt;C:Combination of inhibitors could reduce both expression of Notch-1 and p-Akt simultaneously

3 讨论

Notch 基因通过编码跨膜受体而诱发多级生物级联反应从而参与诸如细胞周期转变、分化、增殖、血管生成、细胞迁移和上皮细胞间叶样变等细胞生物学过程［1，3］。它包括四个受体(Notch-1，2，3，4)和五种配体(jagged-1，jagged-2，Delta 样受体1、3、4)。当细胞上的Notch 受体与邻近细胞上的Notch 配体结合后，Notch通路即被激活［6］。激活的Notch 蛋白在金属蛋白酶肿瘤坏死因子-α 转化酶(TACE)和γ-分泌酶复合物(γsecretase complex)的蛋白水解下，释放其细胞内部分ICN，当ICN 进入细胞核后活化Notch-CSL 复合物，则进一步调控多个下游靶基因的表达。如果采用γ-分泌酶复合物的抑制剂GSI 则能阻断上述过程［7］。

PI3K/Akt 通路在多种癌细胞中呈现高表达，Akt的活化位于PI3K 超家族信号转导过程中的下游，主要负责由PI3K 始动的生物信息的传导，处于这一通路的中心环节。采用特异性抑制剂降低其下游磷酸化Akt的水平，从而阻断Akt的磷酸化活化及其下游信号级联反应进而阻断PI3K 通路的生物学效应［2］。

本实验应用Notch 信号通路的抑制剂GSI和PI3K/Akt 信号通路的抑制剂LY294002 分别单独和联合处理胃癌SGC-7901 细胞。MTT和Western blotting检测发现Notch 信号通路的抑制剂GSI 能抑制癌细胞的增殖，降低蛋白Notch-1的表达水平，而p-Akt的表达水平则较对照组增加。LY294002 能抑制癌细胞的增殖，并降低p-Akt的表达水平，Notch-1 水平则无明显变化，两种信号通路的抑制剂联合应用后能明显降低癌细胞的增殖率，p-Akt和Notch-1 蛋白的表达水平均降低。这就提示Notch 信号通路被抑制后PI3K/Akt信号通路被某种程度的上调，在此基础上应用PI3K/Akt 通路抑制剂抑制该通路，两条通路均被抑制，癌细胞的增殖抑制率则更明显，提示中间存在某个共同的环节联系这两条通路。国外学者［3-5］在急性淋巴细胞白血病T 细胞中发现，Notch 信号途径能够激活Pten基因，而该基因的激活能下调PI3K/Akt 通路的活性。如果Notch 被其抑制剂GSI 抑制，则Pten 基因也被相应地抑制，解除了对PI3K/Akt的下调，表现为Akt 磷酸化活性的增高。如果抑制Notch的同时抑制PI3K/Akt，则癌细胞的抑制率明显增加，这与本实验的结果相符。

国内学者发现胃癌SGC-7901 细胞呈中度表达Pten 基因［8-9］。根据本次实验结果我们推测，Notch 信号通路在胃癌SGC-7901 细胞系中可能通过Pten 基因与PI3K/Akt 通路相联系，Notch 调控Pten，而Pten 调控PI3K/Akt，共同参与胃癌SGC-7901 细胞系的分子生物学过程。两信号通路间可能还有其他的分子间作用联系，有待进一步发现和研究。

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