蛋白质组学在人类疾病研究中的应用

王 玉 综述 刘志红 审校

2001-02-12参与人类基因组计划的美国、日本、德国、法国、英国及中国的科学家们联合公布了人类基因组图谱及初步分析结果，意味着后基因组时代的到来，生命科学转向对基因功能的阐释。由于mRNA的交替剪接、编辑或翻译起始与终止位点的变化及翻译后蛋白质的加工修饰等机制的存在，基因表达与蛋白质水平两者并不完全一致。由于蛋白质才是生命活动的具体执行者，后基因组时代仍以蛋白质为研究对象，才能实现对生命活动的完整认识。1994年，Wilkins等［1］首先提出了蛋白质组的概念。目前将蛋白质组定义为一个基因组、一个细胞或一种生物体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学则以蛋白质组为研究对象，分析蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态的动态变化，阐明蛋白质之间的相互作用及在整体水平上研究蛋白质组成与调控的活动规律。

近年来，由于质谱灵敏度和速度的大大提升，复杂蛋白质组质谱前预处理技术(高丰度蛋白的去除及胰酶酶切的引入)的逐渐建立，各种标记或非标记定量技术层出不穷，极大提升了蛋白质组学技术。蛋白质组学应用于临床疾病研究的主要任务是寻找与疾病诊断、预后、提示药物疗效和不良反应的标志物，探寻疾病发病机制和病理生理过程。目前蛋白质组学在肿瘤、心血管疾病、肾脏疾病等领域得到广泛应用，本文对其相关进展做一综述。

蛋白质组学概述

蛋白质组学常用技术

质谱法 通过质谱测定样品离子的质荷比(m/z)进行成分和结构分析，常用生物质谱技术有以下3种：(1)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)；(2)电喷雾离子化质谱(ESI-MS)；(3)串联质谱(MS/MS)。质谱法首先需要分离蛋白质，双向凝胶电泳(2-DE)可根据等电点和分子量的不同，区分一个样品中的数千种蛋白质，是最常用和最有效的蛋白质分离技术。2-DE对极酸或极碱、高分子质量、低丰度、疏水性和极难溶性蛋白质的分辨率较低，目前二维或多维色谱分离技术(LC)、二维毛细管电泳(CE)和液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术有补充和取代2-DE的趋势。

蛋白质芯片法 通过模仿基因芯片，检测与芯片发生结合的蛋白质，进行蛋白质功能研究、蛋白质-蛋白质相互作用研究及某些疾病的诊断或治疗方面的研究［2］。

蛋白质组学研究方法

发现蛋白质组学 通过对两个或几个组研究对象进行比较，寻找显著差异点。常选用质谱研究法，虽可能发现某种新的潜在标志物，但并非以假设为基础，是类似大海捞针的实验技术。

目标蛋白质组学 运用ELISA或蛋白质芯片对前期研究发现的标志物进行针对性分析，最近也有使用多反应监测(MRM)质谱对某个特定蛋白质群进行靶向研究的报道［3］，这类技术特别适用于检测某种特定蛋白质的表达水平及变化，但不适于寻找与某种病理生理过程相关的新标志物。

目前常用的蛋白质组学研究路线是首先通过发现蛋白质组学寻找候选标志物，再通过目标蛋白质组学进行验证(图 1)［4］。

图1 蛋白质组学寻找标志物流程图：发现、验证及应用［4］

蛋白质组学与肿瘤

胰腺癌 胰腺癌是一种高致死率和高侵袭性疾病，患者平均生存时间不足6月。Rong等［5］使用免疫吸附技术去除高丰度蛋白，采取2D-DIGE/MS分析5例胰腺癌和5例对照患者血清发现16种差异表达蛋白。运用Western Blot在16例患者中进行验证发现，甘露糖结合凝集素1和肌球蛋白轻链激酶2为潜在诊断标记物。Fiedler等［6］收集了40例胰腺癌患者和40例对照血清，使用特异性磁珠纯化富集血清多肽后行MALDI-TOF-MS分析，外部数据验证发现m/z 3884、5959能正确判断胰腺癌的准确性分别达86.3%、97.6% ，前者结合CA199诊断胰腺癌的曲线下面积(AUC)值达1.00，MALDI-TOF/TOF-MS鉴定该多肽为血小板因子4，ELISA验证发现其在胰腺癌和正常人血清中表达有差异。

肝癌 小肝细胞癌(HCCs)对于手术治疗反应良好，但传统应用的早期肝癌标志物甲胎蛋白并不能很好预测小细胞肝癌。Sun等［7］收集了40例HCC患者和36例正常对照的病理切片标本［7］，进行MALDI-TOF/TOF检测筛选候选生物标志物，再进行免疫印迹和qPCR确认。ELISA法在88个HCC患者和64个对照的血清中对以上确认的组织标志物进行验证发现，体积较小(≤2 cm)HCC患者的血清波形蛋白明显过表达，进一步研究证实波形蛋白单独或与甲胎蛋白联合均可作为检测体积较小的HCCs的诊断标记物。Yeo等［8］对HCC患者癌组织及癌旁正常组织进行基于二维凝胶电泳的比较蛋白质组学分析发现，六种外源酶在肿瘤组织中表达明显下调，其中苯酚磺基转移酶(sulfotransferase，SULT1A1)在Western Blot验证中得到确认，进一步研究发现，SULT1A1的下调与国际抗癌联盟分期及血清甲胎蛋白水平密切相关。SULT1A1可能成为筛查早期HCC的生物标记物，并有助于预测HCC的临床疗效。

卵巢癌 有研究联合蛋白质芯片/SELDI-TOFMS在血清中寻找卵巢癌早期诊断标志物，发现三种差异表达蛋白：载脂蛋白A1(APOA1)、甲状腺转运蛋白和人类间α胰蛋白酶H4重链。此三种标志物联合CA125诊断早期卵巢癌的敏感度、特异度均优于CA125单独应用。研究者将该研究进一步深化，研发了一种卵巢肿瘤的分流方法OVA1TM，最近已获美国食品及药品管理局(FDA)批准。当与临床评估(如影像和体格检查)联合时，这一基于免疫测定的分析方法(包括 β2微球蛋白、APOA1、CA125、转铁蛋白和转甲蛋白)在恶性肿瘤高危女性人群中具有阳性预测价值。OVA1评分可帮助医师决定恶性肿瘤高危患者是否可从转诊至妇科肿瘤治疗中获益［9］。该试剂盒得到FDA的批准是蛋白质组学寻找标志物从实验室走向临床进程中的一个标志性成果。该研究也提示面对一种复杂疾病，单一标志物并不能取得很好的区分效果，联合多种标志物可能会获得更好的敏感度和特异度。

膀胱癌 发现候选标志物只是寻找疾病相关标志物的第一步，候选标志物的验证和确认才是寻找标志物的核心。在前期研究中，Moreira等［10］已发现膀胱癌相关蛋白(BLCAP)在疾病组和对照组表达有差异。作为一种新蛋白，BLCAP的结构、功能及细胞定位均未知。该作者通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)预测其结构，并制作相应抗体，通过免疫组化明确其细胞定位发现，BLCAP高表达预示着患者预后不良，提示此蛋白染色模式的分类可能具有预后价值。而且，与单一标记物相比，联合BLCAP及脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)与疾病分级和(或)分期的相关度更为密切。

肺癌 肺癌是导致死亡最常见的肿瘤，目前对其发病机制仍了解甚少。蛋白质组学技术的进步使我们在蛋白质水平上对肺癌发病机制有更深入的了解。Kikuchi等［3］联用等电聚焦(IEF)和非标记定量LC-MS对腺癌、鳞癌、正常对照三组进行深入分析发现，3621个蛋白，鉴别出多种与疾病有关的新的信号通路和差异蛋白，液相-多反应性监测质谱(LC-MRM-MS)和免疫组化对以上新发现进行了验证。为进一步将组织分析中发现的差异蛋白转化血清中疾病的早期诊断标准物，作者运用ELISA对其中部分差异蛋白在血液中表达水平进行检测发现，鳞癌患者血浆内基质金属蛋白酶2(MMP2)较对照组明显升高。

蛋白质组学与心血管疾病

动脉粥样硬化 低水平的高密度脂蛋白(HDL)是动脉粥样硬化的危险因素之一，HDL通过促使胆固醇从外周返回肝脏而发挥抗动脉粥样硬化作用，但其具体机制尚不清楚。Vaisar等［11］使用LC-MS/MS分析了正常人和冠心病患者(CAD)外周血HDL的差别发现，正常人外周血HDL中含有多种补体调节蛋白、色氨酸蛋白酶抑制剂及急性时相蛋白，提示正常人HDL或参与固有免疫，通过抑制炎症和抑制色氨酸蛋白酶参与心脏保护，而CAD患者高密度脂蛋白3(HDL3)内ApoE水平明显升高，另一组独立队列验证了这一发现，提示ApoE有可能成为动脉粥样硬化诊断标志物。

肺动脉高压 肺动脉高压(PH)预后极差，其特征性病理改变为肺动脉重塑导致肺小动脉变窄，但对其病因及发病机制仍了解甚少。Kwapis-zewska等［12］认为在疾病早期可能存在某些触发因素，缺氧是导致PH重要原因之一，研究者将来自缺氧1d小鼠的肺脏与不缺氧小鼠的肺脏进行2DE/MALDITOF-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析。发现多种差异蛋白，其中参与肌肉生成的Fhl-1最受关注，该蛋白在缺氧小鼠明显升高。之后又运用免疫组化、Western Blot在多种PH模型及人类特发性肺动脉高压(IPAH)标本进行验证。为进一步探讨Fhl-1的分子机制，敲除了HIF的基因，发现Fhl-1的调节是HIF依赖的。敲除Fhl-1或过表达Fhl-1，可抑制或促进人类平滑肌细胞增生、迁移。免疫共沉淀联合MALDI-TOF-MS发现Talin1是一种新的Fhl-1的共作用蛋白。

腹主动脉瘤 腹主动脉瘤病理表现细胞外基质的病理性重塑，目前对其发生发展的病理生理机制了解甚少。Didangelos等［13］开发了一种新的亚蛋白质组分离方法，可选择性分离细胞外基质，包括新合成的细胞外基质蛋白和降解产物。采用SDS电泳分离蛋白质混合物，非标记液相色谱-质谱(LC-MS)分析蛋白质成分发现，多种细胞外基质蛋白及基质金属蛋白酶12(MMP-12)在腹主动脉瘤组和对照组存在差别。将正常主动脉组织与MMP-12共孵育后，发现多种新的MMP-12作用底物。

蛋白质组学与肾脏疾病

慢性肾脏病(CKD) Good等［14］使用超滤去除尿液中的大分子量蛋白，运用毛细管电泳-质谱(CE-MS)分析了230例不同病因CKD患者、379例正常人和非肾脏病患者尿液中的小分子量多肽，发现634个潜在标志物，并通过序列分析鉴定出273个。使用支持向量机(SVM)对这273个标志物进行编排组合，发现了一种特异的尿液标志物组合，随后的另一组独立样本证实这个标志物组合诊断CKD的敏感度是85.5%，特异度是100%。

糖尿病肾病 糖尿病肾病是导致终末期肾病(ESRD)的重要病因之一，据估计约1/3的糖尿病微量蛋白尿患者会出现早期肾功能恶化(ERFD)。Merchant等［15］随访了一组微量蛋白尿、无肾功能损害的1型糖尿病肾病患者，随访10～12年，将其分为ERFD组(21例)和非ERFD组(40例)。运用LC/MALDI-TOF-MS对样本中小分子量蛋白质进行分析发现，ERFD组黏蛋白Ⅹ、α1(IV)胶原和 α1(V)胶原3种蛋白质表达下调，5磷酸肌醇2激酶、闭锁小带3和FAT肿瘤抑制因子2等3种蛋白质表达上调。对肾组织标本进行免疫组化分析发现5磷酸肌醇2激酶和闭锁小带3在早期1型糖尿病肾病患者肾组织内表达较正常对照上调。提示这两种蛋白可能成为1型糖尿病肾病ERFD潜在的诊断标志物。

IgA肾病 IgA肾病是我国最常见的原发性肾小球肾炎，也是ESRD常见原因之一。IgA肾病蛋白尿常用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物治疗，但患者对治疗反应性各不相同，Rocchetti等［16］使用2DE/LC-MS/MS分析了18例接受ACEI治疗的IgA肾病患者和20例健康对照的尿液标本发现，激肽原、人类间α胰蛋白酶H4重链和甲状腺转运蛋白3种蛋白在ACEI有效组和无效组含量有差异。Western Blot发现ACEI有效组与无效组治疗前后尿液缓激肽表达差异明显，无效组缓激肽明显低于有效组，提示尿液缓激肽水平可预测ACEI治疗IgA肾病的疗效。

狼疮性肾炎 狼疮性肾炎是一种常见的继发性肾脏疾病，其病程迁延，易复发，目前除肾活检组织病理检查，尚无可靠且方便判断狼疮肾炎活动的指标。Somparn等［17］运用2DE/TOF-TOF-MS/MS分析5例活动性狼疮和5例缓解期狼疮患者的尿液，发现16种差异蛋白。运用ELISA对锌α2糖蛋白和前列腺素H2-D异构酶(PGDS)进行验证发现，锌α2糖蛋白在活动性、非活动性狼疮患者尿液中均升高，而PGDS仅在活动性狼疮患者尿液中升高，提示后者更适合用于判断狼疮的活动程度。

系统性血管炎 目前系统性血管炎已有标准的治疗方案，但缺少监测治疗反应的标志物。Haubitz等［18］运用CE-MS分析活动性肾血管炎患者、健康人、其他肾脏病患者、非肾脏病患者及缓解期肾血管炎患者的尿液标本发现，122种多肽有显著性差异，其中47种通过质谱测序鉴定，运用SVM和线性模型对这47种标志物进行组合发现，二种模型区分活动性和缓解期血管炎的敏感度和特异度都为100%。对10例活动性AAV患者接受免疫抑制治疗治疗前、治疗后1、3、6月的尿液标本进行动态分析发现，这47种标志物随着病情的缓解发生显著变化。

致密物沉积病(DDD) DDD以往称为膜增生性肾炎Ⅱ型，病理表现基膜增厚，细胞增生，系膜基质扩张，其最特征性表现基膜致密层内电子致密物沉积。DDD发病源于补体旁路途径的异常激活，但目前还不清楚基膜沉积电子致密物的具体成分。Sethi等［19］运用显微切割技术从甲醛固定、石蜡包埋的组织中分离出2个肾小球，运用LC-MS进行分析。研究囊括了8例DDD患者，5例正常对照，9例免疫复合物性膜增生性肾小球肾炎患者，分析发现，DDD患者肾小球内补体末端成分C5、C6、C7、C8含量明显升高，提示DDD的发病与补体的异常激活有关之外，还可能由补体终末产物的过度形成介导。抑制补体终末产物的过度形成可能为DDD的治疗带来新的方向。

特发性膜性肾病(IMN) IMN是一种器官特异性的自身免疫病，但长期以来我们并不清楚在人类体内其靶抗原是什么。2009年 Beck等［20］运用Western Blot联用LC-MS发现多数IMN患者血清内存在针对M型磷脂酶A2受体(PLA2R)的抗体，提示PLA2R是IMN的主要靶抗原，为其研究揭开新篇章［20］。最近 Bruschi等［21］提取显微切割下的肾小球内的IgG，运用2DE/LC-MS/MS进行鉴定，发现IMN患者肾小球内存在针对α烯醇化酶的抗体，Western Blot在131例IMN血清中进行验证发现该抗体在1/4患者体内有表达。

小结：蛋白质组学作为功能基因组学的重要组成成分，近十年获得了迅速发展，同时也在面临着质疑——即发表了很多文章，发现了很多标志物，却很少有标志物进入临床。要完成蛋白质组学研究的临床转化还有很多技术瓶颈需要攻克。为了解决目前蛋白质组学研究相对分散，缺少统一的处理流程和标准化方案的问题，欧洲肾脏和尿蛋白质组学组织(European kidney and urine proteomics，EuroKUP)及人类肾脏和尿蛋白质工程(human kidney and urine proteome project，HKUPP)，制定了标准化的尿液收集及储存方案，促进了尿蛋白质组学的发展［22］。蛋白质组学发展到今天，人们越来越清楚地认识到如果说组学的应用是发现科学的开始，那么其验证则离不开经典生物学方法。只有将蛋白质组学的发现与疾病的发生发展联系起来才能将其成果转化到临床应用中。

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