曹 平 赵 玉 张丽丽 沈 婕 邓蓉蓉 宋志霞 赵俊丽 王 静
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统损伤的自身免疫性疾病,狼疮性肾炎(LN)是其最严重的并发症之一,累积发病率亚洲人群最高(55%),其中23%约10年后进展至终末期肾病[1-3]。LN发病可能与遗传、激素、感染、环境等因素有关。近年研究表明,机体的遗传因素在SLE的易感性发病方面处于主导地位,且是多基因协调控制[4,5],但有关 SLE并发LN的机制仍不明确。Kalaaji等[6]研究显示,SLE患者细胞凋亡异常介导的核小体与抗核小体抗体间的作用是LN发生、发展的中心环节。但是,目前对LN凋亡清除机制障碍的始动原因仍不明确。由于细胞凋亡是多基因严格调控的过程,而LN又是多基因表达异常所致的自身免疫性疾病,因此,对LN发病过程中与细胞凋亡有关基因的研究,可望成为阐明LN发病机制的突破口。还有研究显示瓣状内切核酸酶1(Fen1)基因的单核苷酸多态性与SLE有关[7],Fen1 基因位于人类染色体 11q12,长 1144 bp,含有一个外显子,编码380个氨基酸,构成Fen1核酸酶的一级结构,是一种结构特异性多功能核酸酶,在DNA的多条代谢途径、维护染色体的稳定及细胞凋亡过程中发挥着重要作用[8]。该基因的变异与肿瘤及自身免疫性疾病有关[9,10]。Zheng 等[10]通过对Fen1基因E160D点突变模型小鼠研究发现,该模型小鼠细胞凋亡的清除机制发生障碍,导致凋亡产物在肾脏及肺组织中堆积增多,诱发自身免疫反应,造成肾脏免疫性损伤。我们推测在以细胞凋亡异常为主导作用的LN发病机制中,Fen1基因异常可能发挥了很重要的作用,为此,我们检测LN患者肾脏组织细胞凋亡情况和Fen1基因61563142~61563342目的片段,确定其突变及与LN的相关性。
对象 为2009年10月至2012年5月期间兰州大学第二医院肾内科住院确诊LN患者50例,(其中女性45例,男性5例,均为汉族,年龄13~50岁,平均年龄33.48岁),诊断标准符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准的基础上出现以下四条中的任意一条且排除其他导致肾炎因素:(1)24h尿蛋白定量>0.5 g/d;(2)尿中红细胞或白细胞>5个/HP;(3)血清肌酐(SCr)>133 μmol/L;(4)肾活检明确诊断。
健康组选自2009年7月在本院体检中心进行健康检查的汉族健康者25例(女性14例,男性11例),年龄21~43岁(平均29.6岁);胃癌组为2010年10月至2012年5月期间兰州大学第二医院普外科住院汉族患者20例(女性11例,男性9例),年龄45~70岁(平均52岁),所有患者均经胃镜及病理检查确诊而入院接受手术治疗。30例LN患者肾穿刺组织来自于兰州大学基础医学院病理研究所标本库。
主要仪器及试剂 Bio-Rad S1000 PCR仪,JY200 电泳仪,ImageQuant-300,DNA Marker B,柱式全血基因组抽提试剂盒,PCR试剂盒(美国Promega),凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。
研究方法
细胞凋亡检测 按凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作:(1)石蜡切片按常规方法进行脱蜡及水合;(2)切片浸入1×PBS漂洗三次,5 min/次;(3)配制1%Triton X~100通透液;(4)切片浸入通透液中,室温促渗3~5 min;(5)切片浸入1 ×PBS漂洗三次,5 min/次;(6)配制3%H2O2封闭液;(7)切片浸入封闭液,室温(15℃~25℃)封闭10 min;(8)切片浸入1×PBS漂洗三次,5 min/次;(9)配制Proteinase K工作液;(10)每个样本上滴加100 μl Proteinase K 工作液,37℃反应 30 min;(11)切片浸入1×PBS漂洗三次,每次5 min/次;(12)配制100 μl含3000 U 的DNaseⅠ反应液;(13)在一张样本切片上滴加100 μl上述 DNaseⅠ反应液,室温~37℃处理10~30 min;(14)制好的阳性片浸入1×PBS漂洗三次,每次5 min/次;(15)配制 TdT酶反应液;(16)样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴加50 μl TdT酶反应液,加盖玻片放入温盒中,37℃避光反应60 min(阴性对照样本不加TdT酶反应液);(17)反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次,5 min/次;(18)配制Streptavidin~HRP工作液;(19)样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴50 μl Streptavidin~HRP工作液,加盖玻片放入温盒中,37℃避光反应30 min;(20)反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次,5 min/次;(21)配制DAB工作液;(22)样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴加50 μl DAB工作液,室温显色反应30s~5 min;(23)显色后的样本片浸入1×PBS漂洗三次,5 min/次,光镜下观察、拍照;(24)苏木素、甲基绿等常规染液复染。
计算细胞凋亡指数 切片随机选5个视野,每个视野视察100个细胞,计算凋亡指数。回顾性分析肾活检患者的病例资料,根据ISN/RPS 2003狼疮性肾炎分型标准进行病理分型,应用SLE活动度评分(SLEDAI)2000判断其疾病活动度,并进行相关性分析。
标本采集 取受检者清晨空腹外周静脉血2 ml至EDTA抗凝管,轻轻混匀,-80℃保存,待统一提取基因组DNA。
基因组DNA的制备 标本解冻,提取基因组DNA,步骤如下:(1)在500 μl血液中加入800 μl的TBP Buffer用1 ml的 Tip头轻轻吹打使其混匀,4000 r/min离心3min,弃上清;(2)重复上述步骤一次,若血样仍显红色则需再次重复上述步骤,当沉淀为无色或淡红色后用200 μl TE悬浮即可;(3)在准备好的200 μl样品中加入500 μl TBM Buffer,混匀;再加入4 μl Proteinase K,混匀,55.0℃保温 10~20 min;(4)加入260 μl无水乙醇,混匀,用 1 ml Tip 头将样品全部转移到套放于2 ml Collection Tube的UNIQ-10柱中;(5)台式离心机8000 r/min,室温离心1 min;(6)取下UNIQ-10柱,弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中,加入500 μl Wash Solution,10 000 r/min,室温离心2 min;(7)重复步骤(6)一次;(8)取下柱,弃去的全部废液。将柱子放回同一根 Collection Tube中,10 000 r/min,室温离心15s,以除去残留的 Wash Solutions;(9)将UNIQ-10柱放入新无菌的1.5 ml离心管中,在柱膜中央加入40 μl Elution Buffer,室温放置2 min;(10)10 000 r/min室温离心1 min。离心管中的液体即为基因组DNA,-20℃保存。
引物设计 Fen1基因序列来自GenBank(gi|224589802)。引物采用olige 7.0软件设计,引物序列:(1)上游引物-TCAGGCGAGCTGGCCAAACG,下游引物-GTCGCCGCACGATCTCCTCG;(2)上游引物-GCGGGCTGAGGCAGAGAAGC,下游引物-CCAGCCTTCACCAGGGCAGC,设计后由北京华大基因公司合成。
PCR反应 Fen1基因PCR扩增产物为201 bp,PCR试剂盒购于Promega公司,50 μl PCR反应体系及条件见表1。
表1 50 μl PCR反应体系及条件
PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 (1)制备胶,称取0.3g琼脂糖凝胶倒入烧瓶,加入30 ml 0.5×TBE缓冲液,配制成浓度为1.0%的凝胶,加热约3 min;(2)灌胶,将凝胶冷却至60℃左右,加入0.2 μg/ml EB 1 μl,摇匀后缓慢倒入制胶模具,凝胶厚度为3~5 mm,迅速插入梳子,避免产生气泡,置常温下凝固;(3)待凝胶完全凝固后,移去梳子,将凝胶置于电泳槽;(4)加入0.5×TBE缓冲液至电泳槽,液面高出凝胶表面约1 mm;(5)加样孔中加入5 μl PCR扩增产物及50 bp DNA Ladder Marker对照;(6)凝胶电泳,电压80V,电泳30 min;(7)ImageQuant-300凝胶成像系统观察DNA条带,拍照。
序列测定 取目的条带亮、无杂带的PCR产物和上下游引物送至北京华大基因公司进行纯化测序。
在测序结果中寻找突变位点 通过Chromas软件读出测序结果,在基因数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中与 gi|224589802:61563142~61563342进行比较,搜索突变位点。
统计学分析 用SPSS19.0统计软件进行统计学处理,SLE活动指数2000(SLEDAI 2000)与肾脏组织细胞凋亡指数(AI)进行相关分析,基因突变频率及基因型分布在LN患者、胃癌患者、健康者间的比较采用χ2检验。
30例LN患者中,细胞凋亡检测全部阳性,凋亡细胞呈散在分布(图1),LN病理分型与AI、SLEDAI 2000的关系见表2。相关性分析显示,SLEDAI 2000与 AI正相关,r=0.39,P=0.032(图 2)。
图1 LN患者肾脏组织细胞凋亡检测图;A图箭头所示凋亡细胞核为棕褐色;B图为阴性对照;C图为阳性对照(TUNEL,×200)
表2 狼疮性肾炎病理类型与AI、SLEDAI关系
图2 细胞凋亡指数(AI)与系统性红斑狼疮活动指数2000 度评分(SLEDAI,2000)呈正相关
目的基因经PCR后琼脂糖凝胶电泳凝胶成像见1~3条带为LN患者,4、5条带为胃癌患者,6、7健康(图3)。扩增后的目的基因进行测序,并对测序结果与基因数据库中人Fen1基因进行比较后,LN患者、胃癌、健康者 Fen1基因存在 C/—(+61563189)、A/T(+61563198)、A/—(+61563-204),G/T(+61563303)、T/C(+61563304)位点突变(基因测序结果见图 4~6(A),Blast结果见图4~6(B),上述各突变位点统计分析(P>0.05),未发现有统计学意义的碱基变异(表3,4)。
图3 瓣状内切核酸酶1目的基因61563142~61563342片段电泳凝脉成像
图4 A:狼疮性肾炎(LN)患者目的基因测序图谱,B:LN患者目的基因Blast结果
图5 A:胃癌患者目的基因测序图谱;B:胃癌患者目的基因Blast结果
图6 A:健康人群目的基因测序图谱;B:健康人群目的基因Blast结果
表3 狼疮性肾炎(LN)组与胃癌组碱基变异统计分析结果
表4 狼疮性肾炎(LN)组与健康组碱基变异统计分析结果
目前应用糖皮质激素和免疫抑制剂联合治疗可缓解多数LN患者病情,但仍有部分患者对传统的免疫抑制剂治疗无效或效果差。随着对LN发病机制的深入研究,针对发病机制中某一环节或影响发病及疾病进展的关键分子进行选择性靶向治疗,已成为LN治疗的新方向。细胞凋亡清除异常,形成自身抗原,诱发机体产生抗体,导致免疫系统紊乱是LN 发生、发展的中心环节[6,11,12],我们对 30 例 LN患者的肾组织标本进行凋亡检测,所有患者肾组织凋亡检测均阳性,凋亡细胞散在分布肾小球及肾小管,根据ISN/RPS 2003制定的病理分型标准,30例LN患者中以Ⅳ型最多(40.00%),其次Ⅱ型(26.67%),Ⅲ型 16.67%,Ⅴ型 13.33%,Ⅵ 型3.33%,无Ⅰ型病变患者。回顾分析临床资料进行SLEDAI 2000评分发现,SLEDAI与 AI呈正相关。上述结果表明LN患者存在细胞凋亡清除障碍,当大量的凋亡小体在肾组织中滞留时,导致凋亡物质“进出”平衡失调,造成凋亡物质的累积,未及时清除的凋亡细胞质膜破裂后释放出大量的自身内容物,包括核小体碎片、DNA、组蛋白成分等凋亡物质,引发炎症反应和自身免疫,成为维持自身免疫应答的反复性的刺激源,不断攻击已经致敏的免疫系统,破坏其对自身抗原的中枢和外周耐受,出现组织器官受损,进而引发炎症和免疫应答,促使LN的发生、发展[13,14]。本研究发现,凋亡细胞的数量越多,SLE病情越活跃,说明在LN进程中,凋亡产物累积越多,造成的肾脏损害越严重,进一步证明细胞凋亡障碍在其疾病进展及恶化中的作用。
探寻LN患者细胞凋亡障碍的机制,有效地对其进行扳正和修复,才能获得LN根本的治疗效果,而对LN凋亡障碍机制的探讨,更多应着眼于其分子病因学的研究。基因组稳定性的维持,及DNA的复制和修复,都需要一系列的核酸内切酶和外切酶的参与,Fen1就是其中之一[8],Fen1基因E160D点突变影响Fen1核酸酶功能,致使细胞凋亡过程中核小体DNA链不能有效分解,当大量的凋亡小体在机体组织中滞留时,作为具有免疫原性的靶抗原,构成危险信号对免疫系统造成威胁,诱发肿瘤、自身免疫性疾病等[7,10]。
目前Fen1基因和人类疾病的研究多见于肿瘤领域[9,10],在SLE中鲜见报道。我们曾对43例 LN患者和26例健康者的外周血标本,采用全血基因组DNA柱式试剂盒提取DNA,直接PCR方法扩增Fen1基因外显子包含E160D位点的目的片段,扩增后PCR产物应用基因测序方法检测Fenl基因序列,并对测序结果与基因数据库中Fenl基因进行比较结果发现,LN患者正向测序中存在946位碱基C缺失突变(未发表资料)。
本研究进一步收集50例LN患者,25例健康者,20例胃癌患者的外周血标本,对Fen1基因外显子包含E160D位点的61563142~61563342目的片段进行扩增,扩增后的目的基因进行测序,比较LN患者、胃癌、健康者Fen1基因突变情况。结果显示,三组Fen1基因外显子61563142~61563342目的片段未发现有统计学意义的碱基变异,E160D位点未变异,可能原因为样本量小,人群分布存在差异等,但由于试验样本量有限,而且未对Fen1基因全序列进行测序,Fen1基因在LN发病及进展中的意义还需要扩大样本量进行进一步研究。
对Fen1基因进行全序列研究可能对其在LN发病机制中的作用更有价值,Fen1基因异常在LN动物模型中的研究也为该基因在LN发病机制中的作用提供很大的价值,我们的进一步研究将围绕LN细胞凋亡异常,对大样本的LN人群进行Fen1基因全基因组关联研究,同时在LN动物模型中对Fen1基因的异常在LN细胞凋亡过程及疾病发生发展进程中的作用做进一步探索。
1 Foster MH.T cells and B cells in lupus nephritis.Semin Nephrol,2007,27(1):47-58.
2 Goodnow CC,Sprent J,Fazekas de St Groth B,et al.Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity.Nature,2005,435(7042):590-597.
3 de Zubiria Salgado A,Herrera-Diaz C.Lupus nephritis:an overview of recent findings.Autoimmune Dis,2012,2012:849684.
4 Crispín JC,Liossis SN,Kis-Toth K,et al.Pathogenesis of human systemic lupus erythematosus:recent advances.Trends Mol Med,2010,16(2):47-57.
5 Wong M,Tsao BP.Current topics in human SLE genetics.Springer Semin Immunopathol,2006,28(2):97-107.
6 Kalaaji M,Fenton KA,Mortensen ES,et al.Glomerular apoptotic nucleosomes are central target structures for nephritogenic.Kidney Int,2007,71(7):664-672.
7 Kim I,Hur NW,Shin HD,et al.Associations ofDNaseIV polymorphisms with autoantibodies in patients with.Rheumatology(Oxford),2008,47(7):996-999.
8 Liu Y,Kao HI,Bambara RA.Flap endonuclease 1:a central component of DNA metabolism.Annu Rev Biochem,2004,73:589-615.
9 Zheng L,Dai H,Zhou M,et al.Polyploid cells rewire DNA damage response networks to overcome replication.Nat Commun,2012,3:815.
10 Zheng L,DaiH,Zhou M,etal.Fen1 mutationsresultin autoimmunity,chronic inflammation and cancers.Nat Med,2007,13(7):812-819.
11 Cauwe B,Opdenakker G.Intracellular substrate cleavage:a novel dimension in the biochemistry,biology and pathology ofmatrix metalloproteinases.Crit Rev Biochem Mol Biol,2010,45(5):351-423.
12 Dieker JW,van der Vlag J,Berden JH.Deranged removal of apoptotic cells:its role in the genesis of lupus.Nephrol Dial Transplant,2004,19(2):282-285.
13 Guerra SG,Vyse TJ,Cunninghame Graham DS.The genetics of lupus:a functional perspective.Arthritis Res Ther,2012,14(3):211.
14 Muñoz LE,Lauber K,Schiller M,et al.The role of defective clearance of apoptotic cells in systemic autoimmunity.Nat Rev Rheumatol,2010,6(5):280-289.