环氧基载体固定化K.fragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

路艳丽，秦 艳，刘建福

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134)

酶催化具有高效、绿色、低碳、节能等独特优势。同游离酶相比，通过物理或化学方法固定在载体上的固定化酶可以重复使用，因而显著降低生物催化过程的成本，其在食品、医药、生物化工等领域应用潜力巨大。载体与酶分子之间通过共价键形成固定化酶是实现酶固定化的主要方法之一，然而，传统的载体使用前需要繁琐的活化过程，且载体与酶发生共价结合需要较为剧烈的反应条件，酶容易发生失活从而导致共价结合固定化酶的催化活力低。本实验室开发出了表面含有环氧基的活性载体，该载体使用前无需活化，其在温和的条件下(4～25℃，pH2.0～8.0)即可与酶分子发生共价结合，形成的固定化酶活力回收率高、具有良好的操作稳定性和较高的催化效率。低聚半乳糖能够选择性地促进人体肠道内固有的双歧杆菌等有益菌群的增殖，抑制肠道内腐败菌的生长、减少有害代谢产物的形成、降低癌症等疾病发生的风险的生理功能［1-2］。低聚半乳糖被公认为促进和维持人体健康的“益生素”。其还具有低热能、抗龋齿、低甜度、对酸和热稳定等优异的生理学和加工特性［3］。含有低聚半乳糖的食品在日本和法国被批准作为“特殊健康用途食品”(The foods for specified health use)使用［4］。低聚半乳糖是欧洲市场的主要功能性低聚糖产品，其广泛应用于婴幼儿乳粉、酸奶等乳制品、以及面包、饼干等烘焙食品。本实验的目的是研究环氧基载体共价固定K.fragilis β-D-半乳糖苷酶效率的影响因素，固定化酶催化合成低聚半乳糖的反应条件。目前国内缺乏此方面的相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

K.fragilis β-D-半乳糖苷酶与环氧基活性载体由本实验室制备;高效液相色谱(HPLC)检测用的标准样品，乳糖(β-D-半乳糖-［1→4］→β-D-葡萄糖)，低聚半乳三糖(GOS)［4-0-(0-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖基)-D-吡喃葡萄糖］ 购自Sigma -aldrich 公司。乳糖为食品级;其它试剂均为分析纯。

扫描电子显微镜nano some 403 日本;傅里叶变换红外光谱仪(FTIR) VERTEX 70 德国Bruker公司;电子天平FA2004 上海舜宇恒平科技仪器有限公司;真空干燥箱FDU-810 日本制造;全自动比表面积测定仪 理学院提供。

1.2 环氧基载体的制备与表征

分别取甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)5mL、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)5mL、甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)4mL 与10mL 异丙醇混合作为有机相，将1g 聚乙烯戊二醇溶解于200mL 去离子水中作为水相。水相倒入500mL 四径圆底烧瓶中，水浴加热至65℃保温，之后在氮气保护下加入有机相。加入1g 过氧化苯甲酰作引发剂，75℃聚合反应3h 得到微米尺度的球型环氧基载体。反应结束后，用50%乙醇淋洗载体2～3 次，冷冻干燥备用。用移液器吸取无水乙醇分散的环氧基载体于导电胶条上，待自然干燥后，在减压条件下喷金，然后在扫描电镜下观察载体的形貌。

1.3 K.fragilisβ-D-半乳糖苷酶的固定化

2g 载体加入100mL 含有5.0mg/L 乳糖酶的磷酸钾缓冲液(pH6.5，0.05mol/L)中，在25℃、60r/min 温和摇动的条件下固定化2h 后过滤分离。通过测定酶液与固定化后滤液中蛋白质含量的变化计算固定化的酶量，用牛血清蛋白作标准蛋白。为了研究固定化时间以及初始酶浓度对酶固定化效率的影响，分别采用初始酶浓度在1.0～6.0mg/mL，固定化时间2～14h。

1.4 酶活测定

通过测定单位时间内低聚半乳糖的形成量定义固定化酶的活力。将0.1g 固定化酶加入含有20%的乳糖溶液中，在30℃100r/min 的条件下水解5min，通过将固定化酶与底物溶液分离来终止反应。GOS的含量用高效液相色谱来测定［5］。在30℃pH 为6.5的条件下每分钟从20%(w/v)的乳糖溶液中水解得到1mg 的GOS 所需的酶量定义为一个酶活力单位。

1.5 固定化酶催化合成低聚半乳糖

以乳糖为底物，环氧基载体固定的K.fragilis β-D-半乳糖苷酶作为生物催化剂催化合成低聚半乳糖，反应结束后采用过滤法分离出固定化酶以结束酶反应。为了研究底物浓度与酶反应时间对低聚半乳糖合成量的影响:在酶反应温度30℃下，1g 固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶分别催化底物浓度为50、100g/L 和150g/L 的乳糖溶液反应4h;1g 固定化K. fragilis β-D-半乳糖苷酶分别添加到含有100mL、150g/L 乳糖溶液的固定化酶反应器中，分别反应1、2、3、4、5、6h。

1.6 高效液相色谱(HPLC)检测酶水解法合成的低聚半乳糖

固定化酶催化合成结束后的溶液经过0.45μm微滤膜过滤、稀释后，用HPLC 分析其中的低聚半乳糖的含量。HPLC 的色谱条件为:Shodex RS-101 示差检测器，分离柱Shodex Ks-801，流动相为超纯水，流速1mL/min，进样量10μL。采用归一化法算得单糖、乳糖、低聚半乳糖的含量［6］。

2 结果与分析

2.1 载体的扫描电镜图谱

图1 是采用悬浮聚合制备的Poly (GMA -EGDMA-HEMA)载体的表面扫描电镜图片。由图可知:该载体分散性好，载体表面光滑，近似球形，该微球是平均粒径为200μm 的均一单分散颗粒。

图1 悬浮聚合法合成的固定化酶载体的扫描电镜(粒径约为200μm)Fig.1 Suspension polymerization of synthesis of immobilized enzyme carrier scanning electron microscopy (size of about 200μm)

2.2 初始酶浓度对酶的固定化效率的影响

初始酶浓度对环氧基载体固定化效率的影响如图2，由图可以看出:固定化酶载量随着酶浓度的增加而增大，当超过4mg/mL 左右时随着酶浓度的增加酶载量下降，最大的酶载量是69.8mg/g 载体。

在初始酶浓度为1～3mg/mL 时，固定化半乳糖苷酶的酶活几乎不变，酶活回收率约为70%，当初始酶浓度继续增大时，酶活下降。原因是，当酶浓度增大时，载体表面聚集了大量的酶分子，这样会堵塞酶活性结合位点，阻碍底物分子的扩散［7］。

2.3 固定化时间对酶固定化效率的影响

固定化酶载量随着时间的增加而增大，当固定化时间为10h 时，此时的酶载量达到平衡，不再增加。最大酶载量为72.1mg/g(图3)。固定化时间小于等于8h 时，此时的酶活保持在70.5%左右，当固定化时间继续增大时，固定化酶活就会急剧减小。引起此种现象的原因是当固定化的时间过长时，环氧基与酶之间增加了好多共价环，这样会破坏酶的结构构象，从而引起酶失活［8］。

图2 初始酶浓度对微米尺度载体固定化酶效率的影响Fig.2 Effect of initial K.fragilis β-D-galactosidase concentration on the amount of immobilized enzyme and activity recovery indicates activity recovery of enzyme

图3 固定化时间对微米载体固定化酶的影响Fig.3 Effect of the coupling reaction time on the amount and activity of K.fragilis β-D-galactosidase immobilized onto the micro epoxy support

2.4 酶法合成低聚半乳糖反应液的HPLC 图谱

图4 与图5 分别为乳糖和低聚半乳三糖标准样品的HPLC 图谱，保留时间分别为7.019 和8.900min。

图4 乳糖的高效液相色谱(HPLC)Fig.4 Lactose is of HPLC

图6 为β-D-半乳糖苷酶作用乳糖后酶反应液中各种糖类物质的HPLC 图谱。根据各种糖在凝胶色谱柱Ks-801 的出峰按照分子量从高到低的顺序出现这一规律，通过比较图6 中各峰的保留时间与乳糖、低聚半乳三糖标样的出峰时间(图4 与图5)，可以推知，保留时间为7.380min 的为乳糖、保留时间等于与大于9.541min 的色谱峰为聚合度≥3 的低聚半乳糖，保留时间为6.619min 的峰可能为异构乳糖。

图5 低聚半乳糖的HPLC 图谱Fig.5 GOS is of HPLC

图6 K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化低聚半乳糖合成的酶反应液的HPLC 图谱Fig.6 Half of lactose glucoside enzyme catalysis galactooligosaccharides synthetic enzyme reaction liquid by HPLC mapping

2.5 底物浓度对低聚半乳糖合成量的影响

酶反应体系中GOS 的含量随乳糖浓度的增加而增大(图7)，乳糖的最初浓度由50g/L 增加到150g/L，GOS 的最大量值相应从12g/L 增加到40g/L。乳糖分子可以与β-D-半乳糖苷酶形成聚合物，之后断开乳糖的β-1，4 糖苷键，生成半乳糖基酶复合物，半乳糖基中的C-1 被糖类物质和水攻击，相应生成GOS 和半乳糖，然而这两物质的攻击概率受糖类物质的浓度影响，这就是底物浓度影响酶法合成GOS 产率的主要原因。

图7 底物浓度对酶合成GOS 含量的影响Fig.7 Substrate concentration of enzymatic synthesis galactooligosaccharides influence

2.6 酶反应时间的影响

图8 为K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚乳糖过程中产物和底物的含量随酶反应时间变化的情况。由图可知，随着酶反应的进行，低聚半乳糖及单糖(葡萄糖和半乳糖)等产物的生成量增加，而乳糖(底物)的含量不断下降，反应4h 低聚半乳糖的含量为40g/ L 达到峰值。随着反应继续进行，乳糖的含量基本不变、低聚半乳糖的含量缓慢减少，单糖(葡萄糖和半乳糖)含量继续增加，这可能是由于酶反应4h 后低聚半乳糖的合成反应停止而合成的低聚半乳糖被β-D-半乳糖苷酶缓慢水解。

图8 K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖反应过程Fig .8 Half of lactose catalytic synthesis of enzyme galactooligosaccharides reaction process

2.7 固定化酶重复使用稳定性

固定化酶重复使用稳定性决定着催化反应中酶的使用次数，这一性质对于大规模生产使用至关重要。在环氧基载体上固定化半乳糖苷酶水解半乳糖得到低聚乳糖，用该固定化酶进行此反应，连续十次，随着反应次数的增加酶活力减小，当反应达到十批次时酶活为初始酶活的81.5%。(图9)结果表明，固定化酶在操作条件下非常稳定，适合GOS 的大批生产。这是因为多位点共价结合的酶分子构象稳定性增强，从而防止酶分子的扩散与变性。

3 结论

环氧基载体固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶过程中，固定化时间、酶的初始浓度对共价结合在载体表面的酶量、固定化酶的活力回收率具有重要的影响。酶反应的底物浓度、反应时间等反应条件对固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化水解合成GOS 的产率具有较大的影响。通过酶法生成的GOS产率随着乳糖浓度的增加而增大，当乳糖作为底物时浓度为150g/L，此时GOS 的产率最大，为40g/L。用乳糖作底物，固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶催化乳糖生成GOS，反应4h GOS 的产率达到最大，为40g/L。

图9 固定化酶重复使用稳定性Fig.9 Operational stability of K.fragilis β-D-galactosidase immobilized onto the micro epoxy support during batch synthesis of GOS

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