精神分裂症患者探究性眼球轨迹运动与表皮生长因子4（ERBB4）基因多态性的关联

李梓萌潘超卢天兰阮燕燕朱日升王力芳阎浩岳伟华张岱

精神分裂症是一种临床表现复杂、病因尚不明确的重性精神疾病。到目前为止，已报道精神分裂症的易感基因达1000多个[1]，但不同研究得到阳性验证的易感基因为数不多。因此，研究人员更为关注精神分裂症的生物学标记。已有研究发现精神分裂症患者眼球轨迹运动异常可能是该病的生物学标记之一[2]，本课题组成员前期研究也已发现，探究性眼球轨迹运动（exploratory eye movement，EEM）异常可能是精神分裂症的生物学标记之一[3]。但通过探索EEM相关易感基因以阐释精神分裂症发病机制的报道仍属罕见。课题组前期发现中国汉族人群中表皮生长因子4（V－erb－b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4,ERBB4）基因多态性与精神分裂症有关联[4]，但对于ERBB4基因多态性与EEM的关联尚未见文献报道。因此本研究对139例中国汉族人群精神分裂症患者进行了ERBB4基因多态性与EEM的关联研究。

1 对象和方法

1.1 研究对象来自北京大学第六医院2003年11月至2004年12月住院的精神分裂症患者。入组标准：①符合《美国精神障碍诊断统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders－IV，DSM－IV）精神分裂症的诊断标准，由两名以上精神科医师（其中至少一名为主治医师）独立诊断，且诊断一致；②汉族；③患者本人及其法定监护人签署知情同意书。排除标准：符合DSM－IV诊断标准的其他轴I精神障碍诊断，患有严重躯体疾病、神经系统疾病、有头部外伤史。本研究共入组139例精神分裂症患者，其中男性69例，女性70例；年龄16～49岁，平均（29.2±8.7）岁；受教育年限9～21年，平均（13.1±2.8）年；病程 1～360个月，中位数48个月；阳性和阴性症状评定量表（positive and negative symptom scale，PANSS）总分（76.96±17.85）分，其中阳性症状（22.61±7.09）分，阴性症状（19.37±6.98）分，一般精神病理症状（35.25±9.05）分；服用抗精神病药物的剂量（氯丙嗪当量）为（506.22±284.04）mg/d。本研究已获得北京大学第六医院伦理委员会的审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1 探究性眼球轨迹运动检查 应用眼球轨迹运动标记记录仪（型号：NAC－8，日本提供）对139例患者进行探究性眼球轨迹运动检查，详细实验原理及指标评定方法参见文献[5－6]。

实验步骤：受试者头部戴检查装置，装置两侧各装有微型红外线光源，此光源以“＋”为标记反映眼球活动，并显示在监视器上。装置前上方的自动照相机镜头记录患者正前方屏幕上的投影图像，并将实验资料记录于录像带上。检查时受试者前方1.5m的屏幕上会依次呈现三个水平放置的“S”图形（S1、S2、S3），记录仪记录受试者观看该图形时的眼球轨迹运动。首先，放映图S115s，要求受试者即刻画出该图形；其次，分别放映与图S1稍有不同的图S2和图S3各15s，要求受试者分别予以比较并回答异同之处；第三，再次放映图S115s，要求受试者再次画出该图形。检查在患者住院一周内完成，以保证检查结果的客观一致性。

评定方法：本研究选用反应性探究分（responsive search score,RSS）和认知性探究分（cognitive search score,CSS）作为两项主要评定指标。RSS评定方法：将图S2和图S3各分成7个区域，要求受试者分别注视两幅图各5s，再与图S1作回忆性比较；当检查者最后追问“还有什么不同吗？”，受试者讲出“没有了”时，立即计算受试者在此5s内注视图S2和图S3各个区域的点数，每点记一分，两幅图总分最多14分。CSS评定方法：要求受试者分别注视图S2和图S3各15s，再与图S1作回忆性比较；将图S2和图S3共分成9个部分，凡是对图的两端和两个附着物中的任何部分注视点在3个或3个以上即可记1分，两幅图总分最多9分。

1.2.2 ERBB4基因型检测 抽取所有患者外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝管中，分装血浆和血细胞后保存于－80℃冰箱，采用Qiagen公司生产小量血液基因组DNA抽提试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit）提取全基因组DNA，－80℃保存待用。

本研究前期采用Illumina HumanHap610单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）芯片，分别对746例患者和1 599例对照的620 901个SNP进行基因分型及精神分裂症全基因组关联研究[7]。本研究仅对其中139例接受过EEM检测的精神分裂症患者ERBB4基因的447个SNPs位点的基因型信息进行EEM与ERBB4基因多态性的关联分析。ERBB4基因的447个SNPs位点中，345个SNPs位于ERBB4基因的内含子区，102个SNPs位于ERBB4基因的3’UTR区，各SNPs位点相关遗传信息详细注释参见Illumina网站Human-Hap610 SNP芯片（www.illumina.com）。

1.3 统计学方法采用PLINK v1.07软件对ERBB4基因447个SNPs位点及EEM参数进行数量性状位点分析（quantitative trait locus,QTL），方法为多元线性回归分析（检验统计量为Wald检验的R2值）。多重检验校正采用阳性发现错误率（Positive false discovery rate，pFDR）法，校正后检验水准要求q＜0.2[8]。采用SPSS v16.0进行数据管理和统计学描述。采用 QUANTO 1.2.4软件（http://hydra.usc.edu/gxe），估算目前样本量（n＝139例）的统计效能。

2 结果

2.1 精神分裂症患者的EEM结果 反应性探究分（RSS）范围为5～11分，平均（8.22±1.56）分；认知性探究分（CSS）范围为2～7分，平均（5.06±0.97）分。

2.2 精神分裂症患者EEM与ERBB4基因位点的关联结果 采用QUANTO 1.2.4软件计算目前样本量（n＝139例）的统计效能，设患病率为1%、少见等位基因频率（MAF）为0.2、变异系数R2为0.05、I类错误率α为0.05，估算统计效能约为76%。对EEM与ERBB4基因447个SNPs进行QTL关联分析，结果发现，与精神分裂症患者EEM的RSS和CSS同时关联的SNPs位点共有7个，分别为rs12619728，rs17737553，rs1344906，rs10168717，rs10165449，rs10932380，rs7594456，详见表1。不同基因型携带者之间的RSS和CSS指标差异均存在统计学意义（P＜0.05），且经多重检验阳性发现错误率（pFDR）校正，仍有统计学意义（q＜0.2）。详见表2。

表1 与精神分裂症患者EEM的RSS及CSS同时关联的ERBB4基因的7个SNPs位点信息

3 讨论

眼球运动检查对精神障碍的研究已有百余年的历史，Diefendorf和Dodge等在1908年首次提出精神分裂症患者在注视一个特定的移动目标时存在障碍[9]。Holzman等于1973年首次报道精神分裂症患者存在眼球轨迹运动功能的障碍[6]。近十年来，国内外对此做了大量的研究，均显示大多数精神分裂症患者存在眼球轨迹运动异常[2,10]。目前国际应用的眼球轨迹运动检查主要有三种类型：一类是平稳视踪眼球运动（smooth pursuit eye movement,SPEM）；第二类是扫视眼球运动（saccade eye movement,SEM）；第三类是探究性眼球轨迹运动（exploratory eye tracking movement,EEM）。有研究提示，EEM可能是精神分裂症的生物学标记之一[5,10]，但其机制不详。

到目前为止，国外有若干关于精神分裂症患者眼球轨迹运动与基因多态性的关联研究结果发现，ERBB4基因多态性与精神分裂症患者SPEM和SEM关联[11－12]，但至今尚无文献报道ERBB4基因多态性与精神分裂症患者EEM的关联，因此本研究对精神分裂症患者EEM与ERBB4基因多态性进行了关联研究。有文献报道，RSS的改变对精神分裂症有特征性意义，被认为对遗传学研究有重要价值[6,13－14]。并且RSS和CSS可以反映患者认识、记忆以及信息加工等方面的认知功能。本研究选取EEM的RSS和CSS指标可能也反映了精神分裂症患者认知功能障碍的某种机制。有文献报道，抗精神病药物、病程长短以及临床症状对EEM影响不大[3,15]，因此可排除上述因素对本研究结果的影响。

表2 精神分裂症患者EEM的RSS、CSS指标与ERBB4基因多态性的关联结果

研究发现ERBB4基因多态性与精神分裂症患者SPEM和SEM关联[11－12]，提示ERBB4基因多态性可能与眼球轨迹运动的神经调节机制相关。ERBB4基因位于染色体2q34，含有28个外显子，编码一种跨膜酪氨酸激酶，作为神经调节素1（neuregulin 1,NRG1）的受体，在精神分裂症的神经发育过程（尤其是突触成熟及神经元迁移）中发挥重要的调节作用[16－17]。课题组前期已发现中国汉族人群中ERBB4基因的两个内含子多态性位点与精神分裂症有统计学关联（rs6435689：P＝0.009；rs11887531：P＝0.008）[4]，提示 ERBB4 可能参与调节精神分裂症的发病机制。本研究基于前期精神分裂症的全基因组关联研究结果[7]，提取了精神分裂症患者ERBB4基因的447个SNPs位点的基因型信息进行EEM与ERBB4基因各SNPs的QTL关联分析，发现ERBB4基因上的7个SNPs位点与精神分裂症患者EEM的RSS和CSS指标同时关联，分别为 rs12619728、rs17737553、rs1344906、rs10168717、rs10165449、rs10932380和 rs7594456（p＜0.05），且经多重检验阳性发现错误率（pFDR）校正，仍有统计学意义（q＜0.2）。尽管这一发现与课题组前期所发现的精神分裂症的疾病关联位点（rs6435689、rs11887531）不同[4]，但课题组前期发现ERBB4基因的两个内含子SNPs位点（rs6435689、rs11887531，位于本研究发现阳性关联位点的下游）与精神分裂症发病风险有关联，在一定程度上反映了该基因及其所在染色体区域可能存在精神分裂症发病风险及眼动异常关联的遗传基础，进一步验证了ERBB4基因多态性与精神分裂症患者EEM关联的假说，但其机制需要进一步探索。然而，本研究没有能够重复Bae等[11]报道的韩国人群中精神分裂症患者眼球轨迹运动与ERBB4的SNP（rs7598440）关联的结论，原因可能与不同种族遗传背景差异以及眼球轨迹运动检查类型不同有关。

总之，本研究对汉族精神分裂症患者进行的ERBB4基因多态性与EEM的关联研究结果提示ERBB4基因多态性与精神分裂症患者EEM显著关联，验证了EEM可能是精神分裂症的生物学标记之一，并与精神分裂症的易感基因关联。上述发现仍需在其他人群中进一步验证ERBB4基因多态性与EEM的关联。本研究设计仅对精神分裂症患者EEM与ERBB4基因多态性进行了关联研究，未设置正常对照，因此未能得出EEM异常可能是精神分裂症患者特定的生物学标记的结论[6]，将来拟增加正常对照组以验证该结论。

[1]Allen NC,Bagade S,Mcqueen MB,et al.Systematic meta－analyses and field synopsis of genetic association studies in schizophrenia:the SzGene database[J].Nat Genet,2008,40(7):827－834.

[2]韩永华，吕淑艳，松岛英介，等.精神分裂症患者不同状态探究性眼球轨迹运动研究[J].中国心理卫生杂志,2000,14(2):131－134.

[3]潘超，韩永华，朱日升.首发精神分裂症患者探究性眼球轨迹运动研究[J].中国临床康复,2005,9(32):1－3.

[4]卢天兰，赵振国，阮燕燕，等.精神分裂症与表皮生长因子4(ERBB4)基因多态性的关联研究[J].现代生物医学进展,2010,10(14):2601－2604.

[5]Kojima T,Matsushima E,Ando K,et al.Exploratory eye movements and neuropsychological tests in schizophrenic patients[J].Schizophr Bull,1992,18(1):85－94.

[6]韩永华，沈渔邨，刘粹.精神分裂症患者探究性眼球轨迹运动的研究[J].中华精神科杂志,1998,31(2):94.

[7]Yue WH,Wang HF,Sun LD,et al.Genome－wide association study identifies a susceptibility locus for schizophrenia in Han Chinese at 11p11.2[J].Nat Genet,2011,43(12):1228－1231.

[8]Tiwari AK,Zai CC,Likhodi O,et al.A common polymorphism in the cannabinoid receptor 1(CNR1)gene is associated with antipsychotic－induced weight gain in Schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology,2010,35(6):1315－1324.

[9]Ross RG,Olincy A,Harris JG,et al.Smooth pursuit eye movements in schizophrenia and attentional dysfunction:adults with schizophrenia,ADHD,and a normal comparison group[J].Biol Psychiatry,2000,48(3):197－203.

[10]Kojima T,Matsushima E,Ohta K,et al.Stability of exploratory eye movementsasa markerofschizophrenia－－a WHO multi－center study.World Health Organization[J].Schizophr Res,2001,52(3):203－213.

[11]Bae JS,Pasaje CF,Park BL,et al.Genetic association analysis of ERBB4 polymorphisms with the risk of schizophrenia and SPEM abnormality in a Korean population[J].Brain Res,2012,1466:146－151.

[12]Greenwood TA,Light GA,Swerdlow NR,et al.Association analysis of 94 candidate genes and schizophrenia－related endophenotypes[J].PLoS One,2012,7(1):e29630.

[13]王丽莉，韩永华，朱日升.不同病程的精神分裂症患者探究性眼动分析[J].中国心理卫生杂志,2003,17(10):702－704.

[14]韩永华，朱日升，王鹏，等.探究性眼球轨迹运动对50例精神分裂症患者及家系的分析研究[J].中国心理卫生杂志,2001,15(5):344－346.

[15]韩永华，王丽莉，朱日升，等.精神分裂症和情感性精神障碍患者探究性眼球轨迹运动的比较[J].中国临床康复,2004,8(27):5868－5870.

[16]Lu CL,Wang YC,Chen JY,et al.Support for the involvement of the ERBB4 gene in schizophrenia:a genetic association analysis[J].Neurosci Lett,2010,481(2):120－125.

[17]Neddens J,Buonanno A.Selective populations of hippocampal interneurons express ErbB4 and their number and distribution is altered in ErbB4 knockout mice[J].Hippocampus,2010,20(6):724－744.