多重PCR在诊断无症状性尿道炎、宫颈炎人群中的临床应用

范世珍，林松青，陈安彬（深圳市福田区中医院检验科，广东 深圳 518034）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）、生殖支原体（Mycoplasma genitalium，Mg）和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis，Tv）是引起性传播疾病（Sexually transmitted disease，STD）最常见的病原体[1-3]。然而，这些病原体感染后往往缺乏典型的临床症状，这给临床诊断带来了一定的困难。对于无症状性STD患者而言，常规的细菌培养阴性结果往往容易导致他们忽视自己的病情，从而成为危害极大的传染源。因此，本研究旨在评价多重PCR技术在无症状患者的性传播感染如尿道炎、宫颈炎相关病原体的筛查中具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 标本采集 本文所入选的216例研究对象为2010年7月至2011年12月本院体检人群，其中男性124例，女性92例，年龄平均（31.4±10.1）岁，所有研究对象在纳入研究前均自愿参与并进行了简要的问卷调查。所有研究对象处于性活跃期且无临床症状，年龄在20～60岁。性活跃的定义为连续3个月内有性生活。若3个月内曾有泌尿生殖道感染史，但纳入研究时已被治愈的研究对象不纳入本文研究范围。

1.2 DNA提取 收集50 ml男性首段尿，女性在妇科医生的协助下使用宫颈拭子标本。于室温离心10 min，弃上清，加入1 ml无菌PBS重悬。DNA的提取根据厂家试剂盒提供的方案进行。未及时用于多重PCR的DNA置于-20℃保存。

1.3 多重PCR反应 多重PCR的扩增按照试剂盒说明书步骤进行。本试剂盒中含有Ct等6种病原体保守基因序列中的特异性引物，并含有用于排除标本抑制物存在的内参PCR mix和阳性对照样品。本实验用的PCR仪为Eppendorf公司梯度PCR仪。PCR结束后电泳观察结果，预期片段处出现反应条带判断为阳性。

2 结果

2.1 病原体检出情况 在216例研究对象中，95例（43.98%）患者泌尿生殖道内至少存在一种微生物感染。Ct、Ng、Mg、Uu、Mh和Tv在无症状人群中的感染率见表1。

表1 无症状人群中6种病原体的检出情况[例（%）]

2.2 混合感染情况 在所有研究对象中Ct、Ng、Mg和Tv单一感染分别为10例、1例、1例、2例。此外，多重感染也常见，主要是Ct合并Mh或Uu感染。在感染有Ct的人群中，Uu和Mh的感染率分别为27.8%（5/18）和33.3%（6/18）。此外，Mg和Tv与其他细菌混合感染也常见，见表2。

表2 无症状人群中病原体混合感染情况[例（%）]

3 讨论

Ct、Ng、Mg、Tv等是引起无症状性尿道炎、宫颈炎最重要的病原体[4]。在本研究中，这4种病原体的感染率达12.04%（26/216）。经多重PCR鉴定，Ct感染18例，Ng感染2例，Mg感染2例，Tv感染4例。此外，在这216例无症状人群中复合感染11例。以上结果表明如果医生仅根据患者的症状进行经验性治疗的话，有可能导致治疗失败。因此，立即进行多重检测显得有必要，因为对于多重感染患者而言，可使治疗方案最佳化。相对上述4种病原体，Uu和Mh在STD以及非淋球菌性尿道炎(Nongonococcal urethritis，NGU）中的作用目前仍有争议。尽管有报道称Uu可以导致持续性NGU，但正常人的尿道经常可以分离出Uu。Mh目前也被认为是人体正常寄生菌，但是它在特定条件下（如免疫力低下）可以作为病原体致病[5-6]。通常，泌尿生殖道中Mh定植的概率，男性是4%～13%，女性是21%～54%[7]。本研究证实Mh的感染率男性为2.78%，女性11.57%，略低于报道，这可能与本研究人群的环境与饮食习惯有关。

本文结果显示，Uu和Mh的感染率分别为17.59%和14.35%，但若合并Ct感染，其阳性率上升为27.8%和33.3%。其原因目前仍不清楚，Ct感染后引起的黏膜损伤可能更有利于Uu和Mh的定植。

在多重PCR的反应体系中，由于使用了多对引物，因此能一次性扩增多个目标序列，这为临床医生同时检测许多临床领域的病原微生物提供了方便。尤其是当临床样本量极少或难以多次获取时，多重PCR可以利用单个的样本得到更多的目的片段。Horii等[8]证实，相比普通PCR，多重PCR总体敏感性是96%，特异性是100%，且不存在其他微生物的交叉反应，特别是对于高危人群(如职业性工作者)、有多个性伴侣及免疫力低下人群。通过运用多重PCR，临床医生可以快速鉴定出多种微生物感染，并能对无症状人群及时治疗，从而可以降低性传播病原体的感染率。

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