RBPMS不同剪接体的真核表达和亚细胞定位

付洁 ，王瑜 ，程龙 ，徐小洁 ，张浩 ，宋海峰 ，叶棋浓

军事医学科学院 a.生物工程研究所；b.放射与辐射医学研究所；北京 100850

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）参与RNA前体的剪接、RNA的细胞定位、RNA的稳定性等多种转录后过程。已知的含有RNA识别基序（RNA recognition motif，RRM）的RBP是一类含有一个或数个RRM结构域及附属结构域的RBP。RRM也被称为核糖核蛋白基序（ribonucleoprotein motif，RNP motif）或共有序列RNA结合域（consensus se⁃quence RNA-binding domain，CS-RBD）[1-2]，在哺乳动物组织细胞的生长和分化过程中扮演重要角色，但目前对这类蛋白功能的了解还处于初级阶段。

含RRM的RBP在表达量变化或突变后将引起发育异常和疾病，如Elav类蛋白，其家族包括HuD、HuC、Hel-N1和HuR，该类蛋白在神经系统的发育和功能维持中起重要作用，与痴呆症、小脑退行性病变、脑干炎或脊髓炎等某些神经系统的自身免疫疾病有关。此外，RNA结合基序（RNA binding motif，RBM）的基因也是在Y染色体上克隆到的含有RRM结构域的男性不育相关基因，同样含有RRM结构域的TLS（translocated in liposarcoma）基因与人黏液样脂肪肉瘤的发生有关[3]。含RRM的RNA结合蛋白HuR可以与CAT1 mRNA的3'UTR区结合，减弱miR-122的活性[4]。此外，另一种进化上保守的RNA结合蛋白Dnd1（dead end 1）能抑制几种miRNA与其靶标mRNA位点相互作用，阻碍miRNA的功能，且Dnd1的RRM结构域对于Dnd1发挥抑制miRNA的功能是必需的，揭示了这种在保护某些mRNA免受miRNA介导的抑制中的新作用，也揭示了miRNA调控中的一条新途径[5-6]。SRSF1也是含多个RRM结构域的RBP（也叫做SF2/ASF或ASF/SF2），研究表明，SRSF1在乳腺癌组织中高表达，可通过RRM结构域促进BCL2L11和BIN1的剪切[7]，并可调节血管内皮生长因子（VEGF）的2种剪接体促转移VEGF（165）a和抗转移VEGF（165）b的相对变化水平，使得细胞侵袭性增加[8]。此外，SRSF1可参与cas⁃pase-9的选择性剪接过程，及其在非小细胞肺癌中增强化疗敏感性的作用[9]。综上，目前报道的含RRM的RBP在调控机体功能方面的研究具有重要意义，且具有深入阐明其功能的必要性。

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBP with multiple splicing，RBPMS，又名 Hermes）基因是1996年在研究Werner综合征时首次发现的。该基因位于人类染色体8p11-12上，染色体8p是Werner综合征相关基因富集区[10]，且染色体8p的异常可以导致直肠癌、前列腺癌等多种疾病[11-12]。RBPMS含有RRM结构域，主要有RBP1/4、RBP2和RBP3等3种剪接体，不同剪接体的N端高度同源，有RBM，该基序在脊椎动物和昆虫中是保守的，C端富含α螺旋结构，该结构对于RNA识别的序列特异性具有重要作用，C端具有长度和氨基酸差异。目前对RBPMS的研究较少，已明确其在心脏分化过程中起重要作用，在分化的心肌中高表达，可以调节心肌分化所需要的成熟RNA。然而，如果RBPMS在发育的胚胎中过表达却会抑制心脏的发育，导致一些编码心肌分化标志物的成熟RNA缺失，全部的心肌形态学发育停止。此外，RBPMS在肾脏分化所需要的mRNA代谢过程中也起调节作用[13]。我们拟构建RBPMS的3种剪接体形式，以及RRM结构域缺失的表达载体，初步对其基因表达产物的亚细胞进行定位实验，为深入了解该基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T细胞株由本实验室保存（用含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基，培养于37℃、5%CO2细胞培养箱）；大肠杆菌DH5α和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1由本实验室保存；Lipo⁃fectAMINE2000转染试剂、DMEM培养基购自Invit⁃rogen公司；小牛血清购自杭州四季青公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶及PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取和胶回收试剂盒购自Promega公司；DAPI染色液和显色液均购自威格拉斯公司；预染蛋白marker购自Fermentas公司；抗绿色荧光蛋白αR-GFP抗体和辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司；扩增基因片段的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 重组质粒的构建

以卵巢cDNA文库（Clontech公司产品）为模板，设计不同的引物扩增不同剪接体。RBP1/4、RBP2和RBP3基因的GenBank登录号分别为NM_001008710、NM_001008711、NM_001008712[14]，3 种剪接体氨基酸序列比对结果见图1。用上游引物RBP GFP Eco（5'CCGGAATTCTATGAACAACGGC GGCAAAGC3'）和下游引物RBPA GFP Bam（5'CGC GGATCCTCAGCAGAACTGACGGGA3'）扩增 RBP1/4剪接体；用上游引物RBP GFP Eco和下游引物RBPBGFPBam（5'CGCGGATCCTCAAACAGGAA ACCAGGCCA3'）扩增RBP2剪接体；用上游引物RBP GFP Eco和下游引物RBP GFP Bam（5'CGCG GATCCTCAACATGGGAGCTCCCT3'）扩 增 RBP3 剪接体。PCR体系按照Primestar体系说明书进行。PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 7 min。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PCR产物，将PCR产物插入经同样双酶切的pEGFP-C1载体，得到重组质粒pEGFP-RBP1/4、pEGFP-RBP2、pEGFP-RBP3，将其分别与绿色荧光蛋白EGFP的C端融合表达，以观察不同RBPMS剪接体蛋白在细胞中的定位。

此外，利用重组PCR技术将RBPMS剪接体的RRM缺失，以观察RRM结构域对定位的影响。引物为 RRM-primer1（同RBP GFP Eco）、RRM-prim⁃er4（同 RBP GFP Bam）、RRM-primer2（5'TGCCTTA GCCCGGACCTC3'）、RRM-primer3（5'GAGGTCCGG GCTAAGGCA-3'）。以 pEGFP-RBP3 为模板，用引物 RRM-primer1和 RRM-primer2扩增片段 1（72 bp）、RRM-primer3和RRM-primer4扩增片段2（376 bp），以片段1和2混合为模板，用引物RRM-primer1和RRM-primer4扩增获得RRM结构域的RBPMS。PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 7 min。最后获得的PCR产物（448 bp）用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，插入经同样双酶切的pEGFP-C1载体，得到重组质粒pEGFP-C1-RBP/RRM-。

1.3 哺乳动物细胞的转染

用含10%新生牛血清和双抗的DMEM培养基培养细胞，用不含双抗、含10%新生牛血清的DMEM培养基将人胚肾细胞293T接种于12孔板中，接种量以转染时细胞密度达到70%为宜，培养24 h后进行转染。分别将 2.5 μg pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFP-C1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-、pEGFP-C1按照LipofectAMINE2000脂质体转染说明书进行转染，37℃、5%CO2常规培养24 h后收获细胞，用于Western印迹分析。

1.4 Western印迹

转染24 h后收集细胞，加入SDS加样缓冲液，煮沸10 min，离心后取上清液进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉稀释的抗体αR-GFP，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.5 RBPMS蛋白的细胞内定位检测

将重组质粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-分别转染293T细胞。首先将293T细胞接种于盛有盖玻片的24孔板中，转染过程见前述，细胞密度不宜超过30%，同时转染空载体pEGFP-C1对照，37℃、5%CO2常规培养24 h后将细胞固定染核，吸弃培养基，用PBS洗细胞，用4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，用PBS洗细胞3次，每次10 min，DAPI染色5 min，用PBS洗细胞2次，每次5 min，将盖玻片封片固定到载玻片上，在激光共聚焦荧光显微镜下观察荧光。

2 结果

2.1 不同剪接体重组质粒的鉴定

首先从人卵巢cDNA文库中PCR扩增RBPMS不同剪接体基因的完整编码区，分别获得长约591、615、660、438 bp的cDNA片段，对应RBP1/4、RBP2、RBP3和RBP/RRM-（图2），将各基因片段克隆到带GFP标签的经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-C1上，构建的重组质粒经双酶切鉴定（图3）并测序，几种RBPMS编码区序列完全正确（数据略），证明克隆成功。

2.2 带GFP标签的RBPMS不同剪接体的表达

将重组质粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-分别转染293T细胞，同时转空载体pEGFP-C1作为对照，收集细胞总蛋白质进行SDS-PAGE和Western印迹分析。结果表明，转染pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-、pEGFP-C1的真核细胞分别表达相对分子质量约54×103、55×103、57×103、48×103和30×103的蛋白质，与预期结果相同（图4），证明构建的重组质粒能介导RBPMS不同剪接体在真核细胞中表达。

图1 用DNAMAN软件比对RBP1/4、RBP2和RBP3的氨基酸序列

图2 RBPMS基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图

图3 RBPMS基因重组质粒双酶切鉴定的琼脂糖电泳图

2.3 RBPMS不同剪接体形式蛋白在细胞内的定位

将重组质粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-和pEGFP-C1空载体转染293T细胞，在激光共聚焦荧光显微镜下可见转染空载体pEGFP-C1的细胞中的荧光分布于整个细胞，而转染了不同RBPMS剪接体的重组质粒的微观分布模式各不相同。pEGFPC1-RBP1/4围绕胞核在核膜的周围呈聚集状分布；pEGFP-C1-RBP2则在细胞质和细胞核中均有分布，但会出现斑点状聚集；pEGFP-C1-RBP3呈半月状紧密分布在细胞核周围；而RRM结构域缺失后的pEGFP-C1-RBP/RRM-的上述现象消失，与空载体对照类似，在细胞核和细胞质中均有分布。

3 讨论

图4 带EGFP标签的RBPMS在293T细胞中的表达

mRNA转录和转录后调控在基因表达调控中具有重要作用，基因在核内完成转录后，新合成的pre-mRNA或核异质RNA（hnRNA）通过加帽、剪接和加尾等一系列反应成为成熟的mRNA，并被转运至细胞质，在细胞质内mRNA的定位、翻译和代谢等过程受到严格的调控。其中，转录后的调控决定着基因表达的最终产物的种类和表达量[1]。目前已在动物、植物、真菌和细菌等不同物种中发现了约300个含RRM的RBP，该类蛋白参与RNA生物学活性调节的每一步骤，包括转录、pre-mRNA的剪接、RNA加尾修饰、转运、定位、翻译和代谢，并贯穿和连接这一系列过程，在功能调节中发挥其多样性[15-17]。

作为含RRM的RBP之一，目前对RBPMS的报道较少,其生物学功能仍有待阐明。Northern杂交实验表明RBPMS基因在人的心脏、前列腺、肠道和卵巢中有较强的探针杂交带，在脑、骨骼肌、脾脏、胸腺和外周血淋巴细胞中表达较弱，提示RBPMS的表达受到组织特异性调节。事实上，RBPMS的C端的一些外显子在不同的器官和细胞中表达是不尽相同的，但含有RBM的N端相对保守。比如，RT-PCR结果显示，外显子Ⅵ在HeLa细胞中表达，但在成纤维细胞中检测不到。此外，RBPMS基因的启动子区域含有许多转录因子，如AP2、NF1、Sp1和NF-E1等的结合位点，提示这些转录因子可能调节RBPMS基因的转录活性[9]。为了有效地与RNA结合，RBP通常需要组装成多蛋白复合体，免疫沉淀实验表明，细胞中RBPMS以多拷贝形式存在[12]，也提示RBPMS可能和RNA结合，干预RNA的转运、定位和功能等。

在本研究中，我们构建并表达了RBPMS不同剪接体及RRM结构域缺失的真核表达载体，并且利用激光共聚焦显微镜初步观察了RBPMS的微观分布。对表达蛋白细胞内定位的研究表明，不同形式的RBPMS蛋白的细胞微观分布模式明显不同，转染空载体质粒的细胞中荧光信号弥散分布于整个细胞内，主要定位在胞浆中；而RBP1/4、RBP3略同，呈聚集状紧密围绕细胞核分布；RBP2在细胞质和细胞核中均有分布，但会出现斑点状聚集；RRM结构域缺失后，会改变RBPMS的分布模式。几种不同形式的RBPMS的微观定位，提示其调节翻译过程和mRNA的稳定性，且不同的剪接体发挥不同的功能。这为进一步了解RBPMS基因的功能奠定了基础。

图5 激光共聚焦实验显示不同RBPMS的细胞微观分布

RRM结构域对基因微观分布模式有影响。冷泉港实验室的Spector研究小组提出[18]，有一群mRNA分子滞留在核内，在荧光显微镜水平，它们出现不规则的点状结构，大小和形状不同，当用电子显微镜检查时，它们被看作是集群染色质颗粒，该类mRNA分子在结构上被命名为核斑（nuclear speck⁃le）。Billy等[19]将GFP融合表达PSF并结合激光共聚焦实验，确定了参与该蛋白在细胞核和亚核分布的序列。如同其他剪接因子，PSF定位于除核仁以外的细胞核，并呈现出核斑结构。PSF包含N端富含谷氨酸、谷氨酰胺的结构域，2个RRM结构域，以及含有核定位信号的C端结构域，上述因素使PSF完全定位于细胞核中。而RRM2结构域缺失可以导致核斑现象消失，PSF弥散分布于细胞核中。表明RRM结构域参与PSF以核斑形式分布在细胞核。此外已明确，在一些基因中，RRM结构域相当于核定位信号（nuclear location signal，NLS）的作用，如锥形虫中TcUBP1的RRM结构域，酵母中Lhp1p和Pab1p基因的RRM3和RRM4的部分序列，哺乳动物TIA-1、TIAR、PABPC1 等 基 因 的 RRM2 序 列[2]。 此外，RRM结构域也可以介导蛋白-蛋白相互作用[20]。因此，含RRM的RBP可以发挥多样生物学功能。综上，我们构建了不同剪接体及RRM缺失结构域重组质粒，有助于深入研究RRM在RBPMS发挥功能方面的作用。

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